Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish
Summary
Descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina 43 legante il DNA TAR (TDP-43) dalla luce nei motoneuroni spinali usando zebrafish come modello.
Abstract
L’aggregazione proteica anormale e la vulnerabilità neuronale selettiva sono due dei principali tratti distintivi delle malattie neurodegenerative. Le relazioni causali tra queste caratteristiche possono essere interrogate controllando la transizione di fase di una proteina associata alla malattia in un tipo di cellula vulnerabile, sebbene questo approccio sperimentale sia stato finora limitato. Qui, descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina legante l’RNA / DNA TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish per modellare l’aggregazione citoplasmatica di TDP-43 che si verifica nei motoneuroni degenerativi nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Descriviamo un metodo genetico basato sul cromosoma artificiale batterico (BAC) per fornire una variante optogenetica TDP-43 in modo selettivo ai motoneuroni spinali del pesce zebra. L’elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente la transizione di fase dell’optogenetico TDP-43 nei motoneuroni spinali mediante una semplice illuminazione esterna utilizzando un diodo a emissione luminosa (LED) contro pesci sfrenati. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base di imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e analisi delle immagini con il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte optogenetiche TDP-43 all’illuminazione della luce. Questo protocollo consente la caratterizzazione della transizione di fase TDP-43 e della formazione di aggregati in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA, che dovrebbe facilitare un’indagine delle sue conseguenze cellulari e comportamentali.
Introduction
I granuli di ribonucleoproteine (RNP) controllano una miriade di attività cellulari nel nucleo e nel citoplasma assemblando partizioni senza membrana tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS), un fenomeno in cui un fluido omogeneo demixes in due fasi liquide distinte1,2. Il LLPS disregolato delle proteine leganti l’RNA che normalmente funzionano come componenti del granulo RNP promuove una transizione di fase anormale, portando all’aggregazione proteica. Questo processo è stato implicato nelle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative3,4,5. La valutazione precisa di una relazione causale tra LLPS aberrante di proteine leganti l’RNA e patogenesi della malattia è cruciale per determinare se e come LLPS può essere sfruttato come bersaglio terapeutico efficace. LLPS delle proteine leganti l’RNA è relativamente facile da studiare in vitro e in modelli unicellulari, ma è difficile negli organismi multicellulari, specialmente nei vertebrati. Un requisito critico per l’analisi di tale LLPS in singole cellule all’interno di un ambiente tissutale è quello di esprimere stabilmente una sonda per l’imaging e la manipolazione di LLPS in un tipo di cellula vulnerabile alla malattia di interesse.
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è un disturbo neurologico in definitiva fatale in cui i motoneuroni del cervello e del midollo spinale vengono persi selettivamente e progressivamente a causa della degenerazione. Ad oggi, mutazioni in più di 25 geni sono state associate alla forma ereditaria (o familiare) della SLA, che rappresenta il 5%-10% dei casi totali di SLA, e alcuni di questi geni che causano la SLA codificano per proteine leganti l’RNA costituite da RNP, come hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Inoltre, la forma sporadica di SLA, che rappresenta il 90%-95% dei casi totali di SLA, è caratterizzata dall’aggregazione citoplasmatica di TDP-43 depositato in motoneuroni degeneranti. Una delle principali caratteristiche di queste proteine leganti l’RNA associate alla SLA sono le loro regioni intrinsecamente disordinate (IDR) o domini a bassa complessità che mancano di strutture tridimensionali ordinate e mediano deboli interazioni proteina-proteina con molte proteine diverse che guidano LLPS7,8. Il fatto che le mutazioni che causano la SLA si verifichino spesso negli esami approfonditi ha portato all’idea che la LLPS aberrante e la transizione di fase di queste proteine correlate alla SLA possano essere alla base della patogenesi della SLA9,10.
Recentemente, il metodo optoDroplet, una tecnica optogenetica basata su Cryptochrome 2 che consente la modulazione delle interazioni proteina-proteina da parte della luce, è stato sviluppato per indurre la transizione di fase delle proteine con IDR11. Poiché questa tecnica è stata estesa con successo a TDP-43, ha iniziato a scoprire i meccanismi alla base della transizione di fase patologica di TDP-43 e la sua citotossicità associata12,13,14,15. In questo protocollo, delineiamo un metodo genetico per fornire un TDP-43 optogenetico a tipi di cellule vulnerabili alla SLA, vale a dire, motoneuroni spinali nel pesce zebra utilizzando il BAC per il gene mnr2b / mnx2b che codifica per una proteina omeodominio per la specifica del motoneurone16,17. L’elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente una stimolazione luminosa semplice e non invasiva del TDP-43 optogenetico che innesca la sua transizione di fase nei motoneuroni spinali. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base per l’imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e l’analisi delle immagini utilizzando il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte del TDP-43 optogenetico alla stimolazione della luce. Questi metodi consentono un’indagine sulla transizione di fase del TDP-43 in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA e dovrebbero aiutare a esplorare le sue conseguenze patologiche a livello cellulare e comportamentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’espressione mediata da mnr2b-BAC di opTDP-43h e EGFP-TDP-43z nel pesce zebra offre un’opportunità unica per l’imaging dal vivo della transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali. La trasparenza ottica dei tessuti corporei delle larve di zebrafish consente la stimolazione optogenetica semplice e non invasiva di opTDP-43h. I confronti tra i singoli motoneuroni spinali nel tempo hanno dimostrato che l’oligomerizzazione dipendente dalla luce di opTDP-43h causa il suo clustering citoplasmatico, che ricorda l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numeri JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
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