TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定
Summary
グルコース取り込みは、FRETベースの遺伝的にコードされたグルコースセンサーによって示されるように、TAR DNA結合タンパク質(TDP-43)タンパク質障害の影響を受ける ショウジョウバエ 運動ニューロンにおいて増加する。
Abstract
筋萎縮性側索硬化症は、診断後2〜5年以内に進行性筋力低下および死亡を引き起こす神経変性疾患である。臨床症状は、体重減少を含みます, 脂質異常症, および高代謝;しかし,これらは運動ニューロン変性とどのように関連しているのかは不明である。細胞質含包、運動機能障害、寿命の減少を含むALSのいくつかの特徴を再現するTDP-43タンパク質障害の ショウジョウバエ モデルを用いて、最近、幅広い代謝欠陥を同定した。これらの中で、解糖はアップレギュレートされ、遺伝的相互作用実験が補償神経保護機構の証拠を提供することが判明した。実際、ホスホフルクトキナーゼのアップレギュレーションにもかかわらず、解糖症における率制限酵素は、食事および遺伝子操作を用いた解糖の増加が、TDP-43タンパク質症のフライモデルにおける運動機能障害および寿命の増加を緩和することが示された。さらに、運動ニューロンにおける解糖性フラックスに対するTDP-43タンパク質症に対する影響を調べるには、以前に報告された遺伝的にコードされたFRETベースのセンサFLII12Pglu-700μδ6が使用された。このセンサーは、FRETペアとして細菌性グルコースセンシングドメインとシアンおよび黄色の蛍光タンパク質で構成されています。グルコース結合の際、センサはコンフォメーション変化を起こしてFRETが発生する。FLII12Pglu-700μδ6を用いて、グルコース取り込みは、変異体を引き起こすALSであるTDP-43G298Sを発現する運動ニューロンにおいて有意に増加することが判明した。ここでは、TDP-43タンパク質症のコンテキストでグルコースセンサFLII12Pglu-700μδ6を発現する幼虫腹側神経コード製剤におけるグルコース取り込み 、ex vivo、を測定する方法を示す。このアプローチは、グルコース取り込み量を測定し、異なる細胞タイプまたはALSおよび関連する神経変性疾患を引き起こす様々な突然変異の文脈での解糖束を評価するために使用することができる。
Introduction
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は現在不治の進行性神経変性疾患です。ALSは、運動協調の喪失、不可逆的な麻痺、呼吸不全、および診断2〜5年以内の最終的な死につながる上下運動ニューロンに影響を与える1。ALSは、体重減少、脂質異常症、および高代謝(2でレビュー)などの代謝欠陥に関連付けられている。しかし、代謝におけるこれらの変化が運動ニューロン変性とどのように関連しているのかは不明である。ALSおよび関連する神経変性疾患における共通の分母は、TDP-43、RNA処理3、4、5のいくつかのステップに関与する核酸結合タンパク質である。TDP-43の変異は患者の3%〜5%にしか影響しないが、野生型TDP-43タンパク質は、ALS症例の>97%の細胞質凝集体内に見られる(6でレビュー)。この病理は、細胞質介在物、ロコモ運動機能不全および寿命の減少を含むALSの複数の側面を再現する運動ニューロンにおけるヒト野生型または変異体TDP-43(G298S)の過剰発現によってショウジョウバエでモデル化された。これらのモデルを用いて、TDP-43タンパク質症がピルビン酸レベルおよびホスホフルクキナーゼ(PFK)mRNAの有意な増加を引き起こすことが最近報告された、解糖酵素9の速度制限酵素。PFK転写物の同様の増加は、患者由来の運動ニューロンおよび脊髄において認められ、解糖症がTDP-43タンパク質症の文脈においてアップレギュレートされることを示唆した。興味深いことに、食事および遺伝子操作を用いた解糖のさらなる増加は、運動神経細胞を変性する代償的な神経保護機構と一致する、TDP-43タンパク質障害のフライモデルにおける運動機能障害および寿命の増加などのいくつかのALS表現型を緩和した。
さらに、TDP-43タンパク質症のショウジョウバエモデルにおける糖分解の変化をプローブし、グルコース取り込み量を測定するために、以前に報告された遺伝子組み換えFRETベースのセンサFLII12Pglu-700μδ610は、UAS-GAL4発現系を用いて運動ニューロンで発現した。FLII12Pglu-700μδ6グルコースセンサーは、細胞レベルでグルコースを検出するために、緑色蛍光タンパク質(シアンおよび黄色蛍光タンパク質)の2つの変異体間の共鳴エネルギー移動を使用します。これは、分子の反対側の端にあるCFPとYFPに融合した大腸菌MglB遺伝子からの細菌グルコース結合ドメインからなる。グルコース分子に結合すると、センサーはCFPとYFPを近づけてFRETを発生させ、細胞内グルコースレベル10、11、12を定量するために使用できる立体構造変化を受ける(図1)。ここでは、FLII12Pglu-700μδ6センサーを使用して、運動ニューロンにおけるTDP-43タンパク質症によるグルコース取り込みの変化を決定する方法を示す。ここで説明する実験は、ALS関連変異体TDP-43G298Sの過剰発現が、コントロールと比較してグルコース取り込みの有意な増加を引き起こすことを示している。このアプローチは、他のタイプのALS(例えば、SOD1、C9orf72など)および/または他の細胞タイプ(例えば、グリア、筋肉)で、神経変性に関連するグルコース取り込みの変化を決定するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで詳細に説明する技術は、FLII12Pglu-700μδ6を用いた生きたショウジョウバエにおける特定の細胞型のグルコース取り込み量を測定するために適用することができる、10、11、12の範囲にグルコースレベルの変化を検出することができるFRETベースのセンサである。このセンサーは、以前は、ニューロン9…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ショ ウジョウバエ 株を提供してくれたステファニー・シルマイヤーと岩翼武志に感謝します。また、アリゾナ大学のマーリーイメージングコアでイメージングを支援してくれたパトリシア・ヤンスマに感謝します。この研究は、国立衛生研究所NIH NS091299、NS115514(DCZ)、HHMIギリアムフェローシップ(EM)、学部生物学研究プログラム(HBへ)によって資金提供されました。
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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