जंगली केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड कई रोगाणुओं से जुड़े होते हैं, अक्सर आंत लुमेन में या आंत को संक्रमित करते हैं। यह प्रोटोकॉल आंत को उपनिवेशित करने वाले अपरिवर्तनीय रोगाणुओं को समृद्ध करने के लिए एक विधि का विवरण देता है, जो डाउर छल्ली के प्रतिरोध का लाभ उठाता है।
Caenorhabditis elegans (C. elegans) मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन और माइक्रोबायोम का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल साबित हुआ है, विशेष रूप से आंतों के संदर्भ में। हाल ही में, जंगली केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड के पारिस्थितिक नमूने ने बैक्टीरिया, वायरस, कवक और माइक्रोस्पोरिडिया सहित संबंधित रोगाणुओं की एक विविध सरणी की खोज की है। इनमें से कई रोगाणुओं में दिलचस्प उपनिवेशीकरण या संक्रमण फेनोटाइप होते हैं जो आगे के अध्ययन की गारंटी देते हैं, लेकिन वे अक्सर अपरिवर्तनीय होते हैं। यह प्रोटोकॉल C. elegans और संबंधित नेमाटोड में वांछित आंतों के रोगाणुओं को समृद्ध करने और छल्ली का पालन करने वाले कई दूषित रोगाणुओं की उपस्थिति को कम करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में जानवरों को विकास के डाउर चरण में मजबूर करना और बाहरी संदूषण को हटाने के लिए एंटीबायोटिक और डिटर्जेंट वॉश की एक श्रृंखला का उपयोग करना शामिल है। जैसा कि डाउर जानवरों में शारीरिक परिवर्तन होते हैं जो नेमाटोड को कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों से बचाते हैं, किसी भी आंतों के रोगाणुओं को इन स्थितियों से संरक्षित किया जाएगा। लेकिन, काम करने के लिए संवर्धन के लिए, ब्याज के माइक्रोब को बनाए रखा जाना चाहिए जब जानवर डाउर में विकसित होते हैं। जब जानवर डाउर चरण छोड़देते हैं, तो उन्हें अकेले ही व्यक्तिगत लाइनों में प्रचारित किया जाता है। F1 आबादी को तब वांछित रोगाणुओं या संक्रमण फेनोटाइप के लिए और दृश्यमान संदूषण के खिलाफ चुना जाता है। ये तरीके शोधकर्ताओं को आंतों के लुमेन में अपरिवर्तनीय रोगाणुओं को समृद्ध करने की अनुमति देंगे, जो सी एलिगन्स और इंट्रासेल्युलर आंतों के रोगजनकों के प्राकृतिक माइक्रोबायोम का हिस्सा बनाते हैं। इन रोगाणुओं को तब उपनिवेशीकरण या संक्रमण फेनोटाइप और मेजबान फिटनेस पर उनके प्रभावों के लिए अध्ययन किया जा सकता है।
आनुवांशिक मॉडल जीव C. elegans मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन 1,2 का अध्ययन करने के लिए विवो सिस्टम में एक उत्कृष्ट है। उनके पास अन्य जानवरों की तुलना में अपेक्षाकृत सरल शरीर विज्ञान है, फिर भी, उनके अधिकांश सेल जीव विज्ञान मूल रूप से स्तनधारियों के समान हैं जो उन्हें जैविक अनुसंधान 1,3,4 के लिए एक अच्छा मॉडल बनाते हैं। इसके अतिरिक्त, वे सूक्ष्म हैं, बनाए रखने में आसान हैं, और अपने छोटे जीवनकाल में पारदर्शी रहते हैं। ये गुण मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाले तंत्र में तेजी से अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं और विवो संक्रमण और आनुवंशिक रूप से लचीले मेजबानों के उपनिवेशीकरण के विज़ुअलाइज़ेशन को नियंत्रित करते हैं5,6। अंत में, C. elegans तेजी से बैक्टीरिया, फंगल और वायरल संक्रमणों का जवाब देते हैं, जिससे उन्हें मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन और आंत माइक्रोबायोम 7,8,9 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाया जाता है।
जंगली सी एलिगन्स और अन्य नेमाटोड के नमूने में वृद्धि ने मुक्त रहने वाले नेमाटोड और प्राकृतिक आनुवंशिक भिन्नता 10,11 की पारिस्थितिकी में अनुसंधान के लिए अनुमति दी है। समवर्ती रूप से, नमूनाकरण ने स्वाभाविक रूप से होने वाले जैविक रोगजनकों और रोगाणुओं की खोज में भी वृद्धि की है जो C. elegans12,13,14,15 के साथ बातचीत करते हैं, जिससे कई मेजबान-माइक्रोब मॉडल सिस्टम की स्थापना होती है जो वायरस, बैक्टीरिया, माइक्रोस्पोरिडिया, ओमीसेट्स, या कवक 16,17,18,19,20 के साथ बातचीत का अध्ययन करते हैं। . आमतौर पर, जंगली सी एलिगन्स सड़ने वाले तनों और फलों में पाए जाते हैं, अक्सर अधिक समशीतोष्ण जलवायु में, और ज्यादातर वे आत्म-पुनरुत्पादक होते हैं21। जब इन नमूनों को प्रयोगशाला में लाया जाता है, तो जंगली नेमाटोड को क्लोनल आबादी में अलग किया जाता है, जिससे संबंधित माइक्रोबायोटा की एक सरणी होती है। केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड में रुचि के नए रोगाणुओं की खोज करते समय, जानवरों को अक्सर आसानी से विज़ुअलाइज़ किए गए फेनोटाइप का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण या उपनिवेशीकरण के लिए सीधे जांच की जाती है। उदाहरण के लिए, वायरल संक्रमण को आंतों की संरचनाओं के विघटन के रूप में देखा जा सकता है, और माइक्रोस्पोरिडियन चरणों को मेजबान कोशिकाओं के अंदर बीजाणुओं या मेरोंट्स 14,22 के रूप में देखा जा सकता है। जब भविष्य की जांच के लिए ब्याज के एक माइक्रोब की खोज की जाती है, तो इसे जंगली नेमाटोड में पाए जाने वाले अन्य दूषित रोगाणुओं से अलग किया जाना चाहिए ताकि इसे अलगाव में अध्ययन किया जा सके। कई मामलों में, ब्याज के माइक्रोब को विट्रो में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, जिससे मेजबान नेमाटोड में माइक्रोब को समृद्ध करना आवश्यक हो जाता है।
उदाहरण के लिए, यह प्रोटोकॉल सी उष्णकटिबंधीय के एक जंगली अलगाव का वर्णन करता है जिसमें एक जीवाणु होता है जो नेमाटोड के आंतों के लुमेन के भीतर उपनिवेश करता है, जो एक दिशात्मक तरीके से आंतों के उपकला कोशिकाओं का पालन करता है। फेनोटाइपिक रूप से, बैक्टीरिया आंतों के लुमेन के आंतरिक पक्षों के साथ लंबवत बढ़ता है, जिससे यह एक ब्रिस्टल जैसी उपस्थिति देता है, जिसे जानवर के सभी चरणों में एक मानक नोर्मर्स्की माइक्रोस्कोप पर कल्पना की जाती है, जिसमें डाउर चरण भी शामिल है। सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेट जिस पर यह जंगली सी उष्णकटिबंधीय तनाव उगाया गया था, अन्य रोगाणुओं के साथ दृश्यमान संदूषण शामिल था। इस प्रोटोकॉल को इस अज्ञात पालन बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए प्लेटों पर अतिरिक्त दूषित माइक्रोबियल विकास को कम करने के लिए विकसित किया गया था। नेमाटोड को लुमेन में बैक्टीरिया की रक्षा के लिए डाउर चरण में मजबूर किया गया था, और फिर धोने की एक श्रृंखला का उपयोग करके साफ किया गया था। इसके बाद, अज्ञात जीवाणु प्रजातियों की पहचान आंतों के विच्छेदन और अनुक्रमण के लिए 16 एस राइबोसोमल डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा की गई थी।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल संभावित रूप से जंगली-पकड़े गए नेमाटोड से जुड़े ब्याज के किसी भी माइक्रोब को समृद्ध कर सकता है। इसके बाद, शोधकर्ता लक्ष्य माइक्रोब की पहचान करेंगे, माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विवो संक्रमण या उपनिवेशीकरण फेनोटाइप में कल्पना करेंगे, और मेजबान फिटनेस या मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के अन्य पहलुओं पर प्रभावों का अध्ययन करेंगे। केनोरहाब्डिटिस नेमाटोड के साथ बातचीत करने वाली उपन्यास माइक्रोबियल प्रजातियों के अलगाव और जांच मेजबान प्रतिरक्षा के आनुवंशिक तंत्र और मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के उपन्यास प्रतिमानों को उजागर कर सकती है जो माइक्रोबियल रोगजनन और माइक्रोबायोम अध्ययनों के लिए प्रासंगिक है।
यह प्रोटोकॉल सफाई प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का उपयोग करके जंगली-पृथक केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड से रोगाणुओं के अलगाव और पहचान का वर्णन करता है। कई रोगाणु जंगली-अलग-थलग नेमाटोड से जुड़े होते हैं, और उनमें से कुछ में रोमांचक फेनोटाइप होते हैं जिनका उपयोग मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन और जन्मजात प्रतिरक्षा में भविष्य के अध्ययन के लिए किया जा सकता है। कई कृषि योग्य माइक्रोबायोम और रोगजनक बैक्टीरिया को इन विट्रो बैक्टीरियल विकास 25,26 के लिए मानक तकनीकों का उपयोग करके जंगली केनोरहाबिडिटिस नेमाटोड से अलग किया गया है। हालांकि, सभी रोगाणुओं को विट्रो में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, और उन्हें जंगली नेमाटोड में समृद्ध करना आवश्यक हो जाता है। कुछ रोगाणुओं में एक प्रतिरोधी बीजाणु चरण होता है, जैसे कि माइक्रोस्पोरिडिया, और एसडीएस की उच्च सांद्रता का उपयोग अधिकांश बैक्टीरिया और कवक को मारने के लिए किया जा सकता है, जिससे बीजाणुओं के विशिष्ट संवर्धन की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल अपरिवर्तनीय आंतों के रोगाणुओं को समृद्ध करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है जो एसडीएस और एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिरोधी नहीं हैं।
यहां प्रस्तुत तकनीक शारीरिक परिवर्तनों जैसे कि छल्ली को मजबूत करने, ग्रसनी पंपिंग को दबाने और मुंह को एक बुक्कल प्लग 27 के साथ कवर करने के कारण डाउर जानवरों में देखे गए पर्यावरणीय प्रतिरोध का लाभ उठाती है। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं और 0.25% एसडीएस के साथ रातोंरात इनक्यूबेशन है। इस चरण का उपयोग आंतरिक रोगाणुओं को बरकरार रखते हुए सभी बाहरी रोगाणुओं को मारने के लिए किया जाता है। जबकि C. elegans dauers को 30 min27 के लिए 10% पर उच्च के रूप में एसडीएस सांद्रता से बचने के लिए प्रदर्शित किया गया है, यह प्रोटोकॉल न केवल रोगाणुओं को मारने के लिए एक मध्यम लेकिन लंबे समय तक इनक्यूबेशन का उपयोग करता है, बल्कि बैक्टीरिया को एंटीबायोटिक दवाओं के लिए उजागर करता है। इसके अलावा, एसडीएस की एक मध्यम एकाग्रता यह सुनिश्चित करने में मदद कर सकती है कि अन्य केनोरहाबडिटिस प्रजातियों के डाउर्स जीवित रहते हैं, क्योंकि सी. उष्णकटिबंधीय के एक्सपोजर के संपर्क में 1% एसडीएस रातोंरात सभी डाउर जानवरों की मृत्यु हो गई। यदि सभी डाउर मर जाते हैं, तो एसडीएस की एकाग्रता और / या एसडीएस के संपर्क की लंबाई को कम किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, यदि F1 पीढ़ी की प्लेटों में अभी भी सफाई के बाद दिखाई देने वाला संदूषण है, तो SDS एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय बढ़ाया जाना चाहिए।
एक और महत्वपूर्ण कदम सफाई के बाद एकल डाउर जानवरों का अलगाव है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि एसडीएस और एंटीबायोटिक उपचार के बाद सभी जानवर साफ नहीं हैं। इसलिए, जानवरों को OP50-1 के साथ 10 सेमी NGM प्लेट के केंद्र में रखा जाता है और रेडियल रूप से बाहर की ओर क्रॉल करने की अनुमति दी जाती है। अक्सर अधिक डिस्टल जानवरों को चुनना सबसे अच्छा होता है, क्योंकि OP50-1 के माध्यम से विस्तारित रेंगना छल्ली से जुड़े किसी भी संभावित जीवित रोगाणुओं को हटाने में मदद करने के लिए प्रकट होता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल की एक सीमा की ओर जाता है, क्योंकि यह ब्याज के एक माइक्रोब के लिए समृद्ध करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण होगा यदि यह उच्च आवृत्ति पर आबादी में मौजूद नहीं है। यहां, पालन करने वाला अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया आबादी के 90% -95% में मौजूद था; इसलिए, अधिकांश साफ प्लेटों में माइक्रोबायोम बैक्टीरिया था। हालांकि, यदि ब्याज का एक माइक्रोब आबादी में बहुत कम आवृत्ति पर मौजूद है, तो कई और एफ 1 प्लेटों को स्क्रीन करना आवश्यक हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग संभवतः जंगली नेमाटोड में पाए जाने वाले ब्याज के गैर-कृषि योग्य रोगाणुओं की किसी भी संख्या को अलग करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, माइक्रोब को डाउर छल्ली द्वारा संरक्षित ऊतक में होना चाहिए, जो डाउर जानवरों में जीवित रहने में सक्षम है, और मेजबान में एक अवलोकन योग्य फेनोटाइप है। इस प्रकार, इस तकनीक का उपयोग यहां वर्णित अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया प्रजातियों के अलावा आंतों के लुमेन में अन्य माइक्रोबायोम बैक्टीरिया को समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें बैक्टीरिया भी शामिल हैं जो पालन नहीं करते हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग एक संकाय इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया, बोर्डेटेला एट्रोपी के लिए समृद्ध करने के लिए किया गया था, जो नेमाटोड ओशेयस टिपुले 28 को संक्रमित करता है। संवर्धन के बाद, बी एट्रोपी को एनजीएम प्लेटों पर उपनिवेश बनाने के लिए पाया गया था, यह दिखाते हुए कि तेजी से बढ़ते संदूषकों को हटाने के बाद ब्याज के एक माइक्रोब को विट्रो में कृषि योग्य होने की खोज की जा सकती है। यह तकनीक संभवतः माइक्रोस्प्रेडियन और वायरस के लिए काम करेगी, जिसमें ओरसे वायरस भी शामिल है, एक इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को समृद्ध करने की इस क्षमता को देखते हुए। हालांकि, इन रोगाणुओं को डाउर के अंदर और बाहर संक्रमण से बचने में सक्षम होना चाहिए।
यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि जबकि इस प्रोटोकॉल को जैव सुरक्षा स्तर 1 प्रयोगशाला में किया जा सकता है, आगे माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए एक बाँझ तकनीक को बनाए रखा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल को शोधकर्ता की जरूरतों के अनुसार बदला जा सकता है, जिसमें एंटीबायोटिक दवाओं के प्रकार / सांद्रता, एसडीएस का प्रतिशत, और / या एनवाईस्टेटिन जैसे एंटिफंगल के अलावा शामिल हैं। अक्सर, जंगली-अलग सूत्रकृमि में पाए जाने वाले दूषित रोगाणुओं की संख्या नाटकीय रूप से भिन्न हो सकती है। यहां, एनजीएम प्लेटों पर गैर-OP50-1 ई कोलाई विकास के स्पष्ट नुकसान का उपयोग एक साफ सूत्रकृमि तनाव के लिए रीडआउट के रूप में किया गया था। लेकिन, दूषित रोगाणुओं की गैर-कृषि योग्य आबादी मौजूद हो सकती है, इसलिए संदूषण की सीमा को देखने के लिए 16 एस आरआरएनए एम्प्लिकॉन अनुक्रमण जैसे मेटाजीनोमिक्स विधि का संचालन करना आवश्यक है। एक बार जब कीड़े के तनाव को साफ कर दिया जाता है, तो इसे जमे हुए और भविष्य के अध्ययन के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जंगली नेमाटोड में अपरिवर्तनीय रोगाणुओं को समृद्ध करने की अनुमति देता है, जिससे उन्हें मेजबान फिटनेस पर प्रभावों का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है, उपनिवेशीकरण या संक्रमण के फेनोटाइप को चिह्नित किया जाता है, और मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए आनुवंशिक उपकरणों का लाभ उठाते हैं।
The authors have nothing to disclose.
आप डॉ क्रिश्चियन Braendle और केंद्र Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues फील्ड स्टेशन के लिए धन्यवाद.
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
BD PrecisionGlide Needle – 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
Carbenicillin | Millipore-Sigma | C1389-1G | |
Cefotaxime | Millipore-Sigma | C7039-500mg | |
Chloramphenicol | Millipore-Sigma | C0378-25G | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | 11-303C | |
DreamTaq Polymerase | Fisher Scientific | EP0711 | |
Gentamycin | Millipore-Sigma | G1264-250mg | |
Kanamycin | Millipore-Sigma | K1876-1G | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Streptomycin | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
Tetracyclin | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Watch glasses | VWR | 470144-850 |