Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein
Summary
La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.
Abstract
Le cancer du sein est la principale cause de mortalité chez les femmes. La croissance des cellules cancéreuses du sein et leurs métastases subséquentes sont un facteur clé de sa progression. Bien que les mécanismes impliqués dans la promotion de la croissance du cancer du sein aient été étudiés de manière intensive à l’aide de monocultures de cellules cancéreuses du sein telles que les cellules MCF-7, la contribution d’autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques qui sont intimement impliquées dans la croissance tumorale, n’a pas été étudiée en profondeur. L’interaction cellule-cellule joue un rôle clé dans la croissance et la progression tumorales. La néoangiogenèse, ou le développement des vaisseaux, est essentielle à la croissance tumorale, tandis que le système lymphatique sert de portail pour la migration des cellules cancéreuses et les métastases ultérieures. Des études récentes fournissent des preuves que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques peuvent influencer de manière significative la croissance des cellules cancéreuses. Ces observations impliquent la nécessité de développer des modèles in vitro qui refléteraient de manière plus réaliste les processus de croissance du cancer du sein in vivo. De plus, les restrictions dans la recherche animale nécessitent le développement de modèles ex vivo pour mieux élucider les mécanismes impliqués.
Cet article décrit le développement de sphéroïdes du cancer du sein composés à la fois de cellules cancéreuses du sein (cellules MCF-7 positives aux récepteurs d’œstrogènes) et de cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques. Le protocole décrit une approche détaillée étape par étape dans la création de sphéroïdes à deux cellules en utilisant deux approches différentes, la goutte suspendue (étalon-or et bon marché) et les plaques à fond en U à 96 puits (coûteuses). Des instructions détaillées sont fournies sur la façon de ramasser délicatement les sphéroïdes formés pour surveiller la croissance par dimensionnement microscopique et évaluer la viabilité à l’aide de la coloration des cellules mortes et vivantes. De plus, les procédures pour fixer les sphéroïdes pour la section et la coloration avec des anticorps spécifiques à la croissance afin de différencier les modèles de croissance chez les sphéroïdes sont délimitées. En outre, des détails pour la préparation des sphéroïdes avec des cellules transfectées et des méthodes d’extraction de l’ARN pour l’analyse moléculaire sont fournis. En conclusion, cet article fournit des instructions détaillées pour la préparation des sphéroïdes multicellulaires pour la recherche sur le cancer du sein.
Introduction
L’utilisation d’animaux pour des expériences a des limites. Les études animales ne peuvent pas imiter avec précision la progression de la maladie chez les humains, et les animaux et les humains n’ont pas de réponses identiques aux agents pathogènes. En outre, des restrictions dans l’expérimentation animale en raison de préoccupations concernant la souffrance animale et des problèmes éthiques1,2 limiter de plus en plus les programmes de recherche. In vitro des systèmes ont été largement mis au point pour contourner l’utilisation des animaux; de plus, l’utilisation de cellules humaines a fait in vitro modèles plus pertinents pour l’investigation physiopathologique et thérapeutique. Les cultures cellulaires monocouches conventionnelles (2D) sont largement utilisées car elles imitent les tissus humains dans une certaine mesure. Cependant, les monocultures 2D ne parviennent pas à imiter les organes humains, et les monocultures 2D sont incapables de simuler le microenvironnement complexe des organes d’origine et d’imiter le in vivo situation3,4,5,6. De plus, dans les cultures cellulaires monocouches, les traitements médicamenteux pourraient facilement détruire / endommager toutes les cellules. Il est important de noter que certaines de ces limitations peuvent être surmontées en passant à des cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) multicouches7,8. En fait, il a été démontré que les modèles de culture 3D reflètent mieux la structure cellulaire, la disposition et la fonction des cellules dans les tissus primaires. Ces cultures 3D peuvent être formées en utilisant une variété de lignées cellulaires, semblables à un organe fonctionnel. En effet, il existe deux modèles de cultures 3D. Un modèle produit des sphéroïdes de cellules agrégées qui forment des amas et les réorganisent en sphères (modèles sans échafaudage). Le second donne des organoïdes, qui ont une structure plus complexe et consistent en des combinaisons de plusieurs cellules spécifiques à un organe, qui sont considérées comme une version miniature des organes.9,10. Pour cette raison, les systèmes de culture 3D représentent une technologie innovante avec de nombreuses applications biologiques et cliniques. Ainsi, les sphéroïdes et les organoïdes ont de nombreuses applications pour la modélisation des maladies et les études liées à la médecine régénérative, au dépistage des médicaments et aux études toxicologiques.6,11,12,13,14,15. Les sphéroïdes cancérigènes, dérivés de la technologie 3D, recréent la morphologie et le phénotype des types de cellules pertinents, imitent le in vivo microenvironnement tumoral et modèles de communications cellulaires et de voies de signalisation qui sont opérationnelles pendant le développement de la tumeur16,17,18. En outre, pour améliorer la compréhension de la biologie du cancer, les sphéroïdes / organoïdes tumoraux peuvent également être utilisés pour identifier un traitement anticancéreux potentiel spécifique au patient (personnalisé) et évaluer son efficacité, sa toxicité et ses effets à long terme.19,20,21,22. Les sphéroïdes ont ouvert d’importantes possibilités d’étudier la physiopathologie, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en raison de leur capacité à préserver l’architecture cellulaire et tridimensionnelle des tissus, la capacité d’imiter le in vivo et les interactions cellule-cellule. Cependant, il faut également être conscient des limites de ce système, telles que l’absence de composant vasculaire / systémique, système immunitaire ou nerveux fonctionnel, et le système représente une approche réductionniste par rapport aux modèles animaux. En effet, contrairement aux modèles animaux, les structures 3D ne fournissent qu’une approximation de la biologie au sein d’un corps humain. Comprendre les limites de la méthode 3D peut aider les chercheurs à concevoir des processus plus raffinés et valides pour produire des sphéroïdes qui représentent mieux un organe à plus grande échelle23,24,25.
Le cancer est la principale cause de décès dans le monde, et le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes26,27,28. Pour imiter le microenvironnement complexe du cancer du sein, les sphéroïdes du cancer du sein doivent être cultivés à l’aide de cellules qui jouent un rôle de premier plan dans les tumeurs du sein, c’est-à-dire les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les fibroblastes et / ou les cellules immunitaires. De plus, pour un sphéroïde représentant le cancer du sein, l’expression des récepteurs hormonaux féminins (récepteurs œstrogènes/progestérone), la capacité de conserver l’état histologique de la tumeur de la patiente et la capacité d’imiter la réponse au traitement doivent également être prises en compte. Des études ont montré que les systèmes de co-culture 3D ont une organisation cellulaire similaire à celle du tissu primaire in vivo,ont la capacité de réagir en temps réel aux stimuli, et ont des récepteurs androgènes fonctionnels29,30,31,32. Par conséquent, une approche similaire pourrait être utile pour imiter une tumeur du sein in vitro. Le but du protocole actuel est d’établir une nouvelle méthode de génération de sphéroïdes du cancer du sein. Cette méthode utilise des cellules MCF-7 à récepteurs d’œstrogènes positifs (une lignée cellulaire humaine immortalisée de cellules épithéliales) et des cellules endothéliales vasculaires (HUVEC) ou des cellules endothéliales lymphatiques (HMVEC-DNeo) pour créer un modèle qui imite ou reflète étroitement les interactions entre ces cellules au sein d’une tumeur. Bien que les cellules MCF-7 (sensibles aux œstrogènes) et endothéliales aient été utilisées pour développer des sphéroïdes dans la présente étude, d’autres cellules telles que les fibroblastes qui représentent environ 80% de la masse tumorale du sein pourraient également être combinées à l’avenir pour mieux représenter et imiter la tumeur mammaire.
Il existe plusieurs méthodes pour former des sphéroïdes, telles que: 1) la méthode des gouttelettes suspendues qui utilise la gravité33,34; 2) la méthode de lévitation magnétique qui utilise des nanoparticules magnétiques exposées à un aimant externe 35 , et3)la méthode de microplaque sphéroïde qui est réalisée en ensemençant des cellules sur des plaques à faible fixation36,37. Sur la base des méthodes existantes, qui n’utilisent qu’un seul type de cellule, le présent protocole a été optimisé en utilisant des cellules épithéliales et endothéliales pour mieux imiter les conditions de croissance des tumeurs du cancer du sein in vivo38,39,40,41. Cette méthode peut être facilement réalisée en laboratoire à faible coût et avec un minimum d’équipement. Sur la base des besoins / objectifs du laboratoire, différentes approches ont été utilisées pour former des sphéroïdes et obtenir du matériel cellulaire pertinent à partir de ces sphéroïdes. Dans ce contexte, pour l’analyse de l’ADN, de l’ARN ou des protéines, les sphéroïdes 3D sont produits en co-cultivant des cellules endothéliales et épithéliales avec la méthode de la goutte suspendue. Cependant, pour les études fonctionnelles, par exemple, pour surveiller la croissance cellulaire après une transfection interférente courte (siRNA) et / ou un traitement hormonal, les sphéroïdes sont générés à l’aide de plaques à fond en U.
Le but de ce protocole technique est de fournir une description détaillée étape par étape pour 1) la formation de sphéroïdes multicellulaires du cancer du sein, 2) la préparation d’échantillons pour la coloration histologique et 3) la collecte de cellules pour l’extraction de l’ARN, de l’ADN et des protéines. La méthode de chute suspendue peu coûteuse et les plaques à fond en U plus chères sont utilisées pour former des sphéroïdes. Ici, un protocole pour préparer (fixer) les sphéroïdes pour la section et l’immunocoloration ultérieure avec des marqueurs pour évaluer la prolifération cellulaire, l’apoptose et la distribution des cellules épithéliales et endothéliales dans un sphéroïde est fourni. De plus, ce protocole montre une analyse complète étape par étape des données histologiques à l’aide du logiciel ImageJ. L’interprétation des données biologiques varie en fonction du type d’expérience et des anticorps utilisés. La section des sphéroïdes fixes et la coloration ultérieure des sections ont été effectuées par un laboratoire de pathologie de routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparée aux cultures cellulaires 2D, la technologie révolutionnaire de culture sphéroïde 3D est un outil meilleur et plus puissant pour reconstruire le microenvironnement d’un organe, les interactions cellule-cellule et les réponses médicamenteuses in vitro. Il s’agit du premier protocole décrivant la formation de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires multicellulaires (épithéliales et endothéliales) pour la recherche sur le cancer du sein. Ce protocole assure la croissance 3D sphéroïdal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par la Fondation pour la recherche sur le cancer / subvention de la Ligue suisse contre le cancer KFS-4125-02-2017 à RKD et la subvention de l’Institut national de la santé DK079307 à EKJ.
Materials
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
Referências
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
- Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
- Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
- Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
- Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
- Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
- Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), 935-937 (2017).
- Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
- Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
- Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
- DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
- Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
- Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
- Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
- Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
- Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
- Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
- Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
- Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
- Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Pesquisa do Câncer. 79 (12), 3139-3151 (2019).
- Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
- Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).
