Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama
Summary
La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.
Abstract
El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en las mujeres. El crecimiento de las células de cáncer de mama y su posterior metástasis es un factor clave para su progresión. Aunque los mecanismos implicados en la promoción del crecimiento del cáncer de mama se han estudiado intensamente utilizando monocultivos de células de cáncer de mama como las células MCF-7, no se ha investigado en profundidad la contribución de otros tipos de células, como las células endoteliales vasculares y linfáticas que están íntimamente implicadas en el crecimiento tumoral. La interacción célula-célula juega un papel clave en el crecimiento y la progresión del tumor. La neoangiogénesis, o el desarrollo de vasos, es esencial para el crecimiento tumoral, mientras que el sistema linfático sirve como un portal para la migración de células cancerosas y la metástasis posterior. Estudios recientes proporcionan evidencia de que las células endoteliales vasculares y linfáticas pueden influir significativamente en el crecimiento de las células cancerosas. Estas observaciones implican la necesidad de desarrollar modelos in vitro que reflejen de manera más realista los procesos de crecimiento del cáncer de mama in vivo. Además, las restricciones en la investigación con animales requieren el desarrollo de modelos ex vivo para dilucidar mejor los mecanismos involucrados.
Este artículo describe el desarrollo de esferoides de cáncer de mama compuestos tanto por células de cáncer de mama (células MCF-7 con receptor de estrógeno positivo) como por células endoteliales vasculares y/o linfáticas. El protocolo describe un enfoque detallado paso a paso en la creación de esferoides de doble celda utilizando dos enfoques diferentes, gota colgante (estándar de oro y barato) y placas de fondo en U de 96 pocillos (caro). Se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo recoger delicadamente los esferoides formados para monitorear el crecimiento mediante el dimensionamiento microscópico y la evaluación de la viabilidad utilizando la tinción de células muertas y vivas. Además, se delinean procedimientos para fijar los esferoides para seccionar y teñir con anticuerpos específicos del crecimiento para diferenciar los patrones de crecimiento en los esferoides. Además, se proporcionan detalles para preparar esferoides con células transfectadas y métodos para extraer ARN para análisis molecular. En conclusión, este artículo proporciona instrucciones detalladas para preparar esferoides multicelulares para la investigación del cáncer de mama.
Introduction
El uso de animales para experimentos tiene limitaciones. Los estudios en animales no pueden imitar con precisión la progresión de la enfermedad en humanos, y los animales y los humanos no tienen respuestas idénticas a los patógenos. Además, las restricciones en la experimentación con animales debido a las preocupaciones por el sufrimiento animal y los problemas éticos1,2 restringen cada vez más los programas de investigación. In vitro se han desarrollado ampliamente sistemas para eludir el uso de animales; además, el uso de células humanas ha hecho in vitro modelos más relevantes para la investigación fisiopatológica y terapéutica. Los cultivos celulares monocapa convencionales (2D) son ampliamente utilizados porque imitan los tejidos humanos hasta cierto punto. Sin embargo, los monocultivos 2D no logran imitar los órganos humanos, y los monocultivos 2D no pueden simular el complejo microambiente de los órganos originales e imitar el in vivo situación3,4,5,6. Además, en cultivos celulares monocapa, los tratamientos farmacológicos podrían destruir / dañar fácilmente todas las células. Es importante destacar que algunas de estas limitaciones se pueden superar cambiando a cultivos celulares tridimensionales (3D) multicapa.7,8. De hecho, se ha demostrado que los modelos de cultivo 3D reflejan mejor la estructura celular, el diseño y la función de las células en los tejidos primarios. Estos cultivos 3D se pueden formar utilizando una variedad de líneas celulares, similares a un órgano funcional. De hecho, hay dos modelos de culturas 3D. Un modelo produce esferoides de células agregadas que forman grupos y los reorganizan en esferas (modelos sin andamios). El segundo produce organoides, que tienen una estructura más compleja y consisten en combinaciones de múltiples células específicas de órganos, que se consideran como una versión en miniatura de los órganos.9,10. Debido a esto, los sistemas de cultivo 3D representan una tecnología innovadora con muchas aplicaciones biológicas y clínicas. Por lo tanto, los esferoides y organoides tienen numerosas aplicaciones para el modelado de enfermedades y estudios relacionados con la medicina regenerativa, la detección de drogas y los estudios toxicológicos.6,11,12,13,14,15. Los esferoides cancerígenos, derivados de la tecnología 3D, recrean la morfología y el fenotipo de los tipos de células relevantes, imitan el in vivo microambiente tumoral y modelar las vías de comunicación y señalización de las células que están operativas durante el desarrollo del tumor16,17,18. Además, para mejorar la comprensión de la biología del cáncer, los esferoides/organoides tumorales también se pueden usar para identificar una posible terapia contra el cáncer específica del paciente (personalizada) y evaluar su eficacia, toxicidad y efectos a largo plazo.19,20,21,22. Los esferoides han abierto oportunidades prominentes para investigar la fisiopatología, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos debido a su capacidad para preservar la arquitectura de tejidos celulares y tridimensionales, la capacidad de imitar la in vivo situación, y las interacciones célula-célula. Sin embargo, también se deben ser conscientes de las limitaciones de este sistema, como la falta de componente vascular / sistémico, sistema inmunológico o nervioso funcional, y el sistema representa un enfoque reduccionista en comparación con los modelos animales. De hecho, a diferencia de los modelos animales, las estructuras 3D proporcionan solo una aproximación de la biología dentro de un cuerpo humano. Comprender las limitaciones del método 3D puede ayudar a los investigadores a diseñar procesos más refinados y válidos para producir esferoides que representen mejor un órgano a mayor escala.23,24,25.
El cáncer es la principal causa de muerte en todo el mundo, y el cáncer de mama es el cáncer más común en las mujeres26,27,28. Para imitar el complejo microambiente del cáncer de mama, los esferoides del cáncer de mama deben cultivarse utilizando células que desempeñan un papel destacado en los tumores de mama, es decir, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos y / o células inmunes. Además, para un esferoide que representa el cáncer de mama, también se debe considerar la expresión de los receptores de hormonas femeninas (receptores de estrógeno / progesterona), la capacidad de conservar el estado histológico tumoral del paciente y la capacidad de imitar la respuesta a la terapia. Los estudios han demostrado que los sistemas de cocultivo 3D tienen una organización celular similar a la del tejido primario in vivo,tienen la capacidad de reaccionar en tiempo real a los estímulos y tienen receptores andrógenos funcionales29,30,31,32. Por lo tanto, un enfoque similar podría ser útil para imitar un tumor de mama in vitro. El propósito del protocolo actual es establecer un nuevo método de generación de esferoides de cáncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 con receptores de estrógeno positivos (una línea celular humana inmortalizada de células epiteliales) y células endoteliales vasculares (HUVEC) o células endoteliales linfáticas (HMVEC-DNeo) para crear un modelo que imita o refleja de cerca las interacciones entre estas células dentro de un tumor. Aunque MCF-7 (sensible al estrógeno) y las células endoteliales se han utilizado para desarrollar esferoides en el presente estudio, otras células como los fibroblastos que representan ~ 80% de la masa tumoral de mama, también podrían combinarse en el futuro para representar e imitar mejor el tumor de mama.
Existen varios métodos para formar esferoides, tales como: 1) el método de gotas colgantes que emplea la gravedad33,34; 2) el método de levitación magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expuestas a un imán externo35,y 3) el método de microplaca esferoide que se realiza mediante la siembra de células en placas de baja unión36,37. Sobre la base de los métodos existentes, que utilizan un solo tipo de célula, el presente protocolo se ha optimizado utilizando células epiteliales y endoteliales para imitar mejor las condiciones de crecimiento de los tumores de cáncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método se puede lograr fácilmente en el laboratorio a un bajo costo y con requisitos mínimos de equipo. Sobre la base de la necesidad / objetivos del laboratorio, se utilizaron diferentes enfoques para formar esferoides y obtener material celular relevante a partir de estos esferoides. En este contexto, para el análisis de ADN, ARN o proteínas, los esferoides 3D se producen mediante el cocultivo de células endoteliales y epiteliales con el método de gota colgante. Sin embargo, para estudios funcionales, por ejemplo, para monitorear el crecimiento celular después de una transfección de interferencia corta (siRNA) y / o tratamiento hormonal, los esferoides se generan utilizando placas de fondo en U.
El propósito de este protocolo técnico es proporcionar una descripción detallada paso a paso para 1) la formación de esferoides de tipo multicelular del cáncer de mama, 2) la preparación de muestras para la tinción histológica y 3) la recolección de células para la extracción de ARN, ADN y proteínas. Tanto el método de gota colgante de bajo costo como las placas de fondo en U más caras se utilizan para formar esferoides. Aquí, se proporciona un protocolo para preparar (fijar) esferoides para el seccionamiento y la posterior inmunotinción con marcadores para evaluar la proliferación celular, la apoptosis y la distribución de las células epiteliales y endoteliales dentro de un esferoide. Además, este protocolo muestra un análisis completo paso a paso de los datos histológicos utilizando el software ImageJ. La interpretación de los datos biológicos varía según el tipo de experimento y los anticuerpos utilizados. El seccionamiento de esferoides fijos y la posterior tinción de las secciones fue realizado por un laboratorio de patología de rutina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con los cultivos celulares 2D, la revolucionaria tecnología de cultivo de esferoides 3D es una herramienta mejor y más poderosa para reconstruir el microambiente de un órgano, las interacciones célula-célula y las respuestas a los medicamentos in vitro. Este es el primer protocolo que describe la formación de esferoides a partir de líneas celulares multicelulares (epiteliales y endoteliales) para la investigación del cáncer de mama. Este protocolo garantiza el crecimiento esferoidal en 3…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la subvención KFS-4125-02-2017 de la Fundación para la Investigación del Cáncer / Liga Suiza del Cáncer y la subvención DK079307 del Instituto Nacional de Salud a EKJ.
Materials
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
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