Bröst epitelial och endotelcellssfäroider som en potentiell funktionell in vitro-modell för bröstcancerforskning

Summary

Crosstalk mellan bröst epitelial celler och endotel celler bidrar viktigt till bröstcancer progression, tumör tillväxt och metastasering. I denna studie har sfäroider tillverkats av bröstcancerceller tillsammans med kärl- och/eller lymfatiska endotelceller och visat deras tillämplighet som in vitro-system för bröstcancerforskning.

Abstract

Bröstcancer är den främsta dödsorsaken hos kvinnor. Tillväxten av bröstcancerceller och deras efterföljande metastasering är en nyckelfaktor för dess progression. Även om mekanismerna som är involverade i att främja bröstcancer tillväxt har studerats intensivt med hjälp av monokulturer av bröstcancerceller såsom MCF-7 celler, har bidraget från andra celltyper, såsom vaskulär och lymfatiska endotelceller som är intimt involverade i tumörtillväxt, inte undersökts på djupet. Cell-cell interaktion spelar en nyckelroll i tumör tillväxt och progression. Neoangiogenes, eller utveckling av fartyg, är avgörande för tumör tillväxt, medan lymfsystemet fungerar som en portal för cancer cell migration och efterföljande metastasering. Nyligen genomförda studier ger bevis för att vaskulär och lymfatiska endotelceller kan påverka cancercellstillväxten avsevärt. Dessa observationer innebär ett behov av att utveckla in vitro-modeller som mer realistiskt skulle återspegla bröstcancertillväxtprocesser in vivo. Dessutom kräver begränsningar i djurforskningen att man utarbetar ex vivo-modeller för att bättre klargöra de berörda mekanismerna.

Denna artikel beskriver utvecklingen av bröstcancer sfäroider består av både bröstcancerceller (östrogen receptor-positiva MCF-7 celler) och vaskulär och/eller lymfatiska endotel celler. Protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-metod för att skapa tvåcelliga sfäroider med två olika metoder, hängande droppe (guldstandard och billig) och 96-brunns U-bottenplattor (dyra). Djupgående instruktioner ges för hur man försiktigt plockar upp de formade sfäroiderna för att övervaka tillväxten genom mikroskopisk storlek och bedömning av livskraften med hjälp av döda och levande cellfärgning. Dessutom avgränsas förfaranden för att fixa sfäroiderna för sektionering och färgning med tillväxtspecifika antikroppar för att skilja tillväxtmönster i sfäroider. Dessutom ges detaljer för att förbereda sfäroider med transfectedceller och metoder för att extrahera RNA för molekylär analys. Sammanfattningsvis ger denna artikel djupgående instruktioner för att förbereda flercelliga sfäroider för bröstcancerforskning.

Introduction

Användningen av djur för experiment har begränsningar. Djurstudier kan inte exakt efterlikna sjukdomsprogression hos människor, och djur och människor har inte identiska svar på patogener. Dessutom kan begränsningar av djurförsök på grund av oro för djurs lidande och etiska problem^1,2 allt mer begränsade forskningsprogram. In vitro System har utvecklats i stor utsträckning för att kringgå användningen av djur. Dessutom har användningen av mänskliga celler gjort att in vitro modeller som är mer relevanta för den patofysiologiska och terapeutiska undersökningen. Konventionella monolayer (2D) cellkulturer används ofta eftersom de efterliknar mänskliga vävnader i viss utsträckning. 2D-monokulturer kan dock inte efterlikna mänskliga organ, och 2D-monokulturer kan inte simulera den komplexa mikromiljön hos de ursprungliga organen och efterlikna in vivo situation^3,4,5,6. Dessutom, i monolayer cell kulturer, läkemedelsbehandlingar kan lätt förstöra / skada alla celler. Viktigt är att vissa av dessa begränsningar kan övervinnas genom att byta till flerskikts tredimensionella (3D) cellkulturer^7,8. Faktum är att 3D-kulturmodeller har visat sig bättre återspegla cellstrukturen, layouten och funktionen hos celler i primära vävnader. Dessa 3D-kulturer kan bildas med hjälp av en mängd olika cellinjer, som liknar ett funktionellt organ. Det finns faktiskt två modeller av 3D-kulturer. En modell producerar sfäroider av aggregerade celler som bildar kluster och omorganiserar dem till sfärer (byggnadsställningsfria modeller). Den andra ger organoider, som har en mer komplex struktur och består av kombinationer av flera organspecifika celler, som betraktas som en miniatyrversion av organ^9,10. På grund av detta representerar 3D-odlingssystem en innovativ teknik med många biologiska och kliniska tillämpningar. Således har sfäroider och organoider många tillämpningar för sjukdomsmodellering och studier relaterade till regenerativ medicin, läkemedelsscreening och toxikologiska studier^{6,11,12,13,14,15}. Cancerframkallande sfäroider, härledda från 3D-teknik, återskapar morfologi och fenotyp av relevanta celltyper, efterliknar in vivo tumörmikromiljön och modellcellkommunikation och signalvägar som är i drift under tumörutveckling^16,17,18. För att förbättra förståelsen för cancerbiologi kan tumörsfäroider/organoider också användas för att identifiera en potentiell patientspecifik cancerbehandling (personlig) och bedöma dess effekt, toxicitet och långsiktiga effekter^19,20,21,22. Sfäroider har öppnat framträdande möjligheter att undersöka patofysiologi, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening på grund av deras förmåga att bevara cellulär och tredimensionell vävnadsarkitektur, förmågan att efterlikna in vivo situationen och cell-cellinteraktionerna. Men man måste också vara medveten om begränsningarna i detta system, såsom bristen på vaskulär/ systemisk komponent, funktionellt immun- eller nervsystemet, och systemet representerar ett reduktionistiskt tillvägagångssätt jämfört med djurmodeller. I motsats till djurmodeller ger 3D-strukturer endast en approximation av biologin i en mänsklig kropp. Att förstå begränsningarna i 3D-metoden kan hjälpa forskare att utforma mer raffinerade och giltiga processer för att producera sfäroider som bättre representerar ett organ i större skala^23,24,25.

Cancer är den främsta dödsorsaken i världen, och bröstcancer är den vanligaste cancerformen hos kvinnor^26,27,28. För att efterlikna den komplexa mikromiljön av bröstcancer bör bröstcancer sfäroider odlas med celler som spelar en framträdande roll i brösttumörer, dvs. epitelceller, endotelceller, fibroblaster och/eller immunceller. Dessutom, för en sfäroid som representerar bröstcancer, bör uttrycket av kvinnliga hormonreceptorer (östrogen/ progesteronreceptorer), förmåga att bevara patientens tumör histologisk status och förmåga att efterlikna svar på terapi också övervägas. Studier har visat att 3D-samkultursystem har en cellulär organisation som liknar den primära vävnaden in vivo, har förmågan att reagera i realtid på stimuli och har funktionella androgenreceptorer^29,30,31,32. Därför kan ett liknande tillvägagångssätt vara användbart för att efterlikna en brösttumör in vitro. Syftet med det nuvarande protokollet är att etablera en ny metod för att generera bröstcancersfäroider. Denna metod använder östrogen receptorpositiva MCF-7 celler (en odödliggjord mänsklig cellinje av epitelceller) och vaskulär endotelceller (HUVECs) eller lymfatiska endotelceller (HMVEC-DNeo) för att skapa en modell som efterliknar eller nära återspeglar interaktionerna mellan dessa celler i en tumör. Även om MCF-7 (östrogen-lyhörda) och endotelceller har använts för att utveckla sfäroider i den nuvarande studien, kan andra celler som fibroblaster som representerar ~ 80% av brösttumörmassan också kombineras i framtiden för att bättre representera och efterlikna brösttumör.

Det finns flera metoder för att bilda sfäroider, till exempel: 1) den hängande droppmetoden som använder^{gravitationen 33,34}; 2) den magnetiska levitationsmetoden som använder magnetiska nanopartiklar som utsätts för en extern magnet³⁵och 3) den sfäroida mikroplatta som utförs av såddceller på lågtillsatta plattor^36,37. På grundval av de befintliga metoderna, som endast använder en celltyp, har det nuvarande protokollet optimerats med epitel- och endotelceller för att bättre efterlikna tillväxtförhållandena för bröstcancertumörer i vivo^38,39,40,41. Denna metod kan enkelt uppnås i laboratoriet till en låg kostnad och med minimala utrustningskrav. Baserat på labbets behov/mål användes olika metoder för att bilda sfäroider och få relevant cellulärt material från dessa sfäroider. I detta sammanhang, för DNA, RNA eller proteinanalys, produceras 3D-sfäroiderna genom samodling av endotel- och epitelceller med hängande droppmetod. Men för funktionella studier, till exempel, för att övervaka celltillväxt efter kort störande (siRNA) transfektion och/eller hormonbehandling, sfäroiderna genereras med hjälp av U-bottenplattor.

Syftet med detta tekniska protokoll är att tillhandahålla en detaljerad steg-för-steg beskrivning för 1) bilda bröstcancer multicellulär-typ sfäroider, 2) förbereda prover för histologiska färgning, och 3) samling av celler för extraktion av RNA, DNA och proteiner. Både den billiga hängande droppmetoden och de dyrare U-bottenplattorna används för att bilda sfäroider. Här tillhandahålls ett protokoll för att förbereda (fixa) sfäroider för sektionering och efterföljande immunstaining med markörer för att bedöma cellproliferation, apoptos och distribution av epitelial och endotelceller inom en sfäroid. Dessutom visar detta protokoll en fullständig steg-för-steg-analys av histologiska data med hjälp av ImageJ-programvara. Tolkningen av biologiska data varierar beroende på vilken typ av experiment och vilka antikroppar som används. Sektionering av fasta sfäroider och efterföljande färgning av sektionerna utfördes av ett rutinmässigt patologilabb (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Protocol

1. Cellkultur OBS: Utför cellhantering under sterila förhållanden. Subkultur av human umbilisk ven (HUVECs) Täck 75 cm2 flaskor med kollagen (5 μg/cm2) (råttsvans) över natten (ON) vid rumstemperatur (RT) eller 2-3 h vid 37 °C, skölj med vatten och låt kolven torka. Odla HUVECs i tillväxtmedium (EBM-2, Endotel basal medel-2) kompletterad med glutamin (1x = 2 mM), antibiotisk-antimykotisk lösning (AA; 100 μg/mL streptomycin, 100 μ…

Representative Results

Sfäroider modell med epitelial och endotel och endotel co-kulturer krävs att nära efterlikna in vivo villkor för bröst tumörer för in vitro experiment. Schemat i figur 1 visar protokollet för att bilda sfäroider med epitelceller för bröstcancer och kärl- eller lymfatiska endotelceller (figur 1). Varje celltyp sås separat i en 3,5 cm rund skål och behandlas med tillväxtstimulatorer/hämmare eller transfekteras med oligonukleotider…

Discussion

Jämfört med 2D-cellkulturer är revolutionerande 3D-sfäroidkulturteknik ett bättre och kraftfullare verktyg för att rekonstruera ett organs mikromiljö, cellcellsinteraktioner och läkemedelssvar in vitro. Detta är det första protokollet som beskriver bildandet av sfäroider från multicellulära (epiteliella och endotel) cellinjer för bröstcancerforskning. Detta protokoll säkerställer sfäroidal 3D tillväxt av sfäroider i upp till 5 dagar, och sfäroider kan undersökas efter paraffin inbäddning, …

Materials

100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924