Præsenteret her er en protokol for den standardiserede metode til fremstilling af gnavervæv efter iskæmi-reperfusionseksperimentet og retningslinjer for etablering af belysnings- og kameraopsætninger til billedoptagelse i høj opløsning. Denne metode gælder for al eksperimentel organfotografering af små dyr.
Makrofotografering er anvendelig til billeddannelse af forskellige vævsprøver ved høj forstørrelse for at udføre kvalitative og kvantitative analyser. Vævsforberedelse og efterfølgende billedoptagelse er trin, der udføres umiddelbart efter iskæmi-reperfusionsforsøget (IR) og skal udføres rettidigt og med passende omhu. Til evaluering af IR-induceret skade i hjertet og hjernen beskriver dette papir 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-baseret farvning efterfulgt af makrofotografering. Videnskabelig makrofotografering kræver kontrolleret belysning og en passende billedbehandlingsopsætning. Den standardiserede metode sikrer detaljerede digitale billeder af høj kvalitet, selvom der anvendes en kombination af et billigt opdateret digitalkamera og makroobjektiv. Korrekte teknikker og potentielle fejl i prøveforberedelse og billedoptagelse diskuteres, og der gives eksempler på indflydelsen af korrekte og forkerte opsætninger på billedkvaliteten. Der gives specifikke tip til, hvordan man undgår almindelige fejl, såsom overstaining, forkert prøveopbevaring og suboptimale lysforhold. Dette papir viser den passende metode til udskæring og farvning af rottehjerte og hjernevæv og giver retningslinjer for etablering af belysnings- og kameraopsætninger og fotograferingsteknikker til billedoptagelse i høj opløsning.
I årtier har fotografering og analyse af hjerte- og hjernevævsprøver været en vigtig del af life science-eksperimenter. Videnskabelige og innovative fremskridt driver udviklingen af dyre mikroskoper, der er i stand til superopløsning. Fotomikrografer opnås i et velkontrolleret lysmiljø efter detaljerede instruktioner. I modsætning hertil udføres makrofotografering (ved 1: 2 eller større forstørrelse) ofte i et ukontrolleret lysmiljø ved hjælp af upassende billedopsætninger. Ofte skal teknikkerne til prøveforberedelse og kameraopsætning optimeres væsentligt. Som følge heraf er makrofotografier af begrænset kvalitet blevet bredt offentliggjort i videnskabelige tidsskrifter. Utilstrækkelig billedopløsning og kontrast begrænser mulighederne for præcis billedkvantificering i IR-undersøgelser.
Eksperimentelle procedurer for myokardie1,2 og hjerne3,4 infarkt er blevet beskrevet detaljeret. Formålet med denne undersøgelse er at give en trinvis vejledning om, hvordan man opretter et system til fotografering og standardiseret analyse af gnaverhjerte- og hjernevævsprøver efter infarktforsøg. Dette omfatter vævsskæring, farvning og makrofotografering af hjerte- og hjerneprøver. Fremstillingen af vævsprøver er en væsentlig del af forsøget, og de planimetriske billedanalyseresultater afhænger i høj grad af kvaliteten af de opnåede billeder5.
Disse metoder er især nyttige til at udføre målinger og billedplanimetrisk analyse i gnavervæv og kan være af værdi for generel videnskabelig makrofotografering. Derudover gør billedernes høje kvalitet og konsistens det muligt at udføre automatiseret analyse af digitale fotografier, hvilket hjælper med at spare tid, undgå brugerinput og minimere risikoen for fejl eller bias under billedanalyse. Dette vil resultere i generering af robuste og pålidelige data og øge oversættelsen af prækliniske opdagelser til nye antiiskæmiske behandlinger i klinikker.
Forberedelse af hjertet efter IR starter med reokklusion af blodhjertearterier og perfusion af blåt farvestof til diskrimination af risikoområder fra ikke-risikoområder. Methylenblå eller Evans blå farvestoffer anvendes oftest til dette formål2. Da et for højt tryk kan beskadige hjerteklapper og dermed helt eller delvis plette risikoområder, er det bedre at perfuse hjertet med et trykstyret system, såsom Langendorff-apparatet eller en forenklet version af en hydrostatisk tryksystemudstyret sprøjte eller pumpe. Kontrolleret perfusion vil sikre fysiologisk tryk, og farvestoffet vil normalt ikke komme ind i det okkluderede område af hjertet. Både flowhastigheds- og trykstyrede teknikker er beskyttelsesforanstaltninger mod overstaining.
En af de mest alvorlige fejl i levedygtig vævsbehandling er at holde væv i en fryser i længere tid før farvning. Frysning bruges hovedsageligt, fordi forskere ønsker at udføre hjertefarvning dagen efter IR-eksperimentet eller senere. Desuden bruges frysning til at gøre skæringen af hjertet lettere. Vi fandt ud af, at kortvarig frysning af hjertet i op til 5-10 minutter ubetydeligt påvirker hjertevævets integritet og letter at skære vævene (især for musehjerter) i tynde skiver. Frysning i længere perioder beskadiger imidlertid membraner og nedsætter cellelevedygtigheden og mitokondriefunktionen13. Som følge heraf påvirkes TTC-farvning af fungerende mitokondrier, og grænsen mellem nekrotisk og levedygtigt væv er dårligt afgrænset (sløret). Samlet set bør frysning af rotteharts undgås, og kun kortvarig frysning af musehjerter kan bruges til lettere skæring.
Det næste trin er vævsfarvning i 1% TTC-opløsning ved 37 °C14. Farvningsopløsningen skal være forvarmt – især vigtig for farvning af hjerneskiver. Ved brug af den forvarmede opløsning er den optimale farvningstid for hjerteskiver 10 minutter. En længere inkubation eller en temperatur højere end 37 °C resulterer i brun farve af hjertevævet. Korrekt farvning af prøver og ensartet rød farveintensitet er vigtige for yderligere billedanalyse. I de sidste trin før fotografering skylles vævsskiverne 2-3 gange med kold PBS eller en lignende buffer for at fjerne TTC og overskydende methylenblåt fra opløsningen for at undgå blåstøbning på fotografiet. Hjerteskiver skal fotograferes kort efter farvning for at opnå den bedste billedkvalitet. Hjertefarvning forbliver af god kvalitet, hvis den opbevares i op til 60 minutter i kulden (+4 °C) PBS. Farvede hjerneskiver og aortavæv opbevares normalt i en 4% neutral formaldehydopløsning og bevarer god kvalitet i en uge. Opbevaring af hjernevæv natten over i formalin (+4 °C) forringer ikke farveintensiteten af normalt væv og er acceptabelt til billedoptagelse. Formalin inducerer imidlertid hævelse og aflejring af hjerteskiver. Derfor anbefales det ikke at opbevare hjertevæv i formalin.
Det næste trin er billedoptagelse. Mange laboratorier bruger flatbed-scannere som et billedoptagelsesværktøj, der forventes at erstatte et digitalt kamera og belysningsopsætning. Vi fastslog, at scanningen af skiver ikke giver tilstrækkelig billedopløsning og farveseparation og derfor ikke er egnet til billeddannelse af hjerteskiver. Især scanneropløsningen er utilstrækkelig til musehjerter, og vi bemærkede dårlig gengivelse af methylenblåt. I modsætning hertil kan en scanner være et alternativ til et fotokamera til billeddannelse af hjerneskiver, der kun er farvet med TTC eller andre enkeltfarvestoffer. Til scanning af vævsskiver er scanningssoftware, der sikrer konstante eksponeringsindstillinger, afgørende. Samlet set er en flatbed-scanner mindre i stand til og kan ikke erstatte et digitalt kamera til de fleste billedbehandlingsapplikationer.
Baggrunden bag prøver er også vigtig. Ideelt set bør bunden af bakken være af en farve, der ikke er til stede i den farvede prøve. For eksempel bør hvid, rød, blå, gul og brun baggrund undgås for at kvantificere området med methylenblå og TTC (rød) farvning på en automatiseret eller halvautomatiseret måde. Således ville en grøn baggrund være at foretrække. Ikke desto mindre afhænger farvevalg af operatørens præferencer, som efterbehandler billedet. Mange forskere foretrækker en hvid baggrund, fordi en hvid baggrund kan slettes i billedbehandling og konverteres til helt hvid (RGB hvid kode 255,255,255). Derefter skal man udelukke helt hvid fra listen over udvalgte farver, der anvendes til halvautomatiseret analyse og kun tælle blege nekrotiske områder, som ikke er helt hvide, hvis ikke overeksponerede. Blå og grøn baggrund er velegnet til fotografering af hjerneskiver og aortas.
Det optimale billeddannelsesværktøj til vævsfotografering er et enkeltlinserefleks eller spejlløst udskifteligt objektiv digitalkamera med et kompatibelt makroobjektiv. Optagelse af meget små objekter kan kræve en kombination af et kamera og et mikroskop; Ikke desto mindre har et makroobjektiv normalt tilstrækkelig (mindst 1: 2) forstørrelse til at opnå detaljerede billeder af et musehjerte. Mange producenter tilbyder overkommelige digitale kameraer og makrolinser for at opnå fotografier i høj opløsning og høj forstørrelse. Alle opdaterede digitale kameraer har egenskaber og funktioner, der er nødvendige for makrofotografering, herunder muligheden for at montere på et stativ, et stort antal pixels (normalt >20 Mpx), live view, spejllåsning, time-lapse-funktioner, fjernlukker og muligheden for manuelt at indstille kameraparametre, hvilket sikrer en konstant lukkertid, blænde, hvidbalance og ISO-indstilling. Kompaktkameraer med ovennævnte funktioner og objektivforstørrelse på mindst 1:2 kan også bruges til makrofotografering. På grund af objektivets egenskaber skal nogle kompaktkameraer placeres i nærheden af objektet, og eksperimentatoren skal sikre, at kamerahuset ikke påvirker belysningen af prøven.
Til makrofotografering med enhver form for udskifteligt objektivkamera kræves et makroobjektiv med høj forstørrelse (1:1-1:2). Vi foreslår, at du bruger makroobjektiver med en brændvidde fra 50 mm til 100 (120) mm eller tilsvarende på full-frame-sensoren (24 mm x 36 mm). Mindre sensorkameraer har forskellige sensorstørrelser, og forstørrelse skal genberegnes i overensstemmelse hermed. Til fotografering af hjerteskiver er en ergonomisk afstand fra 100 mm makroobjektivets frontelement til motivet ca. 150 mm. Denne indstilling giver operatørerne mulighed for at opbevare alt udstyret på et bord med nem adgang til kamerakontrollerne. Et 50 mm makroobjektiv kan overvejes til fotografering af større objekter, såsom hjerneskiver, fordi et bredere synsfelt er nødvendigt for at få alle skiver i et enkelt fotografi.
For at opnå skarpe billeder med høj opløsning skal et kamera monteres på et robust stativ, der sammen med en lysopsætning kaldes et fotografisk kopistativ. Montering af kameraet på et stativ og en fjernbetjening (kablet eller trådløs) udløser eliminerer kamerarystelser og sikrer en konstant afstand fra målet. En kamerabelysningsopsætning med to konstant lyskilder fra begge sider, vinklet ca. 30-60° i forhold til motivplanet, sikrer tilstrækkelig belysning af prøver og hjælper med at undgå refleksioner på samme tid. Kameraet skal monteres præcist, så sensoren er parallel med motivplanet. For jævnt at belyse billedfeltet skal begge lamper være lige orienteret og placeret i samme afstand fra motivet. Lyskilder placeret i forskellige afstande fra motivet forårsager ujævn belysning. Derudover er blinkende lyskilder en årsag til variationer i billedeksponeringen. Samlet set er det vigtigt at placere kameraet og lyskilderne nøjagtigt for præcist at få billeder af velbelyste prøver.
Vævsprøver reflekterer lys (glins), der fremstår som hvide pletter på billederne. Disse lysreflektionspletter indeholder ikke nyttige farveoplysninger, og derfor kan disse dele af billederne ikke bruges til nøjagtig kvantitativ analyse af billeder. Lysrefleksioner fra vævsskiver kan fjernes ved forskellige metoder. Den mest effektive er fuld nedsænkning af vævsprøver i en beholder med en saltvands- eller PBS-opløsning. En lignende fremgangsmåde er indsættelse af vævsskiver under (eller mellem) glasplader. Denne metode er effektiv mod refleksioner; Billedopløsningen kan dog være lavere end for fotografier af nedsænket væv.
Man kan også bruge et polariserende filter monteret på en linse for at eliminere lysrefleksioner. Cirkulære polariserende filtre er bredt tilgængelige, men varierer betydeligt i kvalitet afhængigt af pris, og billige filtre kan reducere billedopløsningen betydeligt. Reflekteret lys kan filtreres fra ved at dreje den bevægelige del af polariseringsfilteret i en vinkel. Effekten af det polariserende filter kan blive påvirket af nogle lyskilder (f.eks. Stærkt LED-lys). Samlet set kan et polariserende filter efter fjernelse af ekstra væske eliminere alle refleksioner fra hjerneskiverne; Prøvenedsænkning i bufferopløsning er dog den nemmeste og mest omkostningseffektive tilgang til hjerteskiver.
Manuelle indstillinger af lukkertid, blænde, ISO og hvidbalance er vigtige for at bevare fuld kontrol over billedbehandlingsprocessen. Lyskildens prøve, baggrund og egenskaber påvirker kameraets eksponeringsmålingssystem i automatiske indstillinger; derfor er manuelle indstillinger nødvendige for at opretholde konstant eksponering og hvidbalance mellem flere fotografier under eksperimentet. For makrofotografering er den foreslåede blændeindstilling mellem f/8 og f/16. Ved at reducere blænden øges dybdeskafflen, hvilket er nyttigt, hvis objektet ikke er i et enkelt plan. Diffraktion begrænser dog den samlede opløsning af fotografering i tilfælde af mindre blændeåbninger. Den optimale blænde for de fleste objektiver er normalt f/10, fordi opløsningsfaldet i denne indstilling er ubetydeligt, og dybdeskarphed er tilstrækkeligt. ISO-værdier, der spænder fra 50 til 400 (lavere er bedre) er normalt optimale til at minimere billedartefakter (støj). Lukkertiden skal derefter ændres for at opnå korrekt eksponering ved hjælp af de nævnte blænde- og ISO-indstillinger under eksisterende lysforhold. Manuelle indstillinger er vigtige for ensartet billedanalyse. Standardiseret billeddannelse sikrer brugen af de samme farvetærskelindstillinger i hele enhver undersøgelse, hvilket kræver segmenteringsanalyse. For eksempel kan semiautomatiseret analyse af ImagePro-software baseret på en segmenteringsfil med foruddefinerede farver blå, rød og hvid (+lyserød) bruges gennem årene, hvis prøvebilleder har ensartede farver, hvidbalance og eksponering.
Hvidbalanceindstillingen skal justeres afhængigt af farvetemperaturen på den lyskilde, der bruges til at belyse en prøve. Hvidbalancen kan vælges blandt kameraets indbyggede forudindstillinger eller ved hjælp af manuel kalibrering af et gråt mål. Fordelen ved billedoptagelse i RAW-format er, at hvidbalancen kan justeres under software efterbehandling af billedet. Da RAW-filer indeholder meget mere information end JPEG-filer, giver RAW-filbehandling en glimrende mulighed for korrektion af farvebalance og eksponering samt for at opnå bedre billedopløsning. Da de fleste kameraer kan fange JPEG- og RAW-filer samtidigt, foreslår vi, at du fanger RAW-filen og gemmer den som en sikkerhedskopi.
Samlet set beskriver denne protokol en metode til udskæring og farvning af rottehjerte og hjernevæv og giver retningslinjer for etablering af belysnings- og kameraopsætninger og fotograferingsteknikker til billedoptagelse i høj opløsning til yderligere analyse. Denne metode gælder for al eksperimentel organfotografering af små dyr.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne blev støttet af EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 857394, Projekt FAT4BRAIN.
1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
50 mL syringe | Terumo | N/A | |
Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |