파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발
Summary
유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
유비퀴틴은 유비퀴틴-프로테솜 시스템의 핵심 성분인 작은 8.6 kDa 단백질이다. 따라서, 그것은 높은 특이성 그러나 낮은 친화력을 가진 단백질의 다양한 배열에 결합할 수 있습니다. 파지 디스플레이를 통해 유비퀴틴 변이체(UbV)는 야생형 유비퀴틴에 비해 친화성을 개선하고 표적 단백질에 대한 결합 특이성을 유지하도록 설계할 수 있다. 파지 디스플레이는 파지미드 라이브러리를 활용하여 필라멘트 M13 박테리오파지의 pIII 코트 단백질(파지 표면에 외부적으로 표시되기 때문에 선택)이 UbV와 융합됩니다. 인간 야생형 유비퀴틴의 특정 잔류물은 부드럽고 무작위화되어(즉, 네이티브 야생형 서열에 대한 편견이 있음) UbV를 생성하여 단백질 형성의 해로운 변화를 피하도록 하는 동시에 표적 단백질과의 새로운 상호 작용을 촉진하는 데 필요한 다양성을 도입한다. 파지 표시 과정에서 이러한 UbV는 파지 코트 단백질에 표현되고 표시되며 관심있는 단백질에 대해 패닝됩니다. 대상 단백질과 유리한 결합 상호 작용을 나타내는 UbV는 유지되지만 가난한 바인더는 세척되어 라이브러리 풀에서 제거됩니다. UbV의 해당 파지미드를 포함하는 파지 입자에 부착된 유지 된 UbV는 다른 파지 디스플레이에서 동일한 표적 단백질에 대해 패닝 될 수 있도록 용출, 증폭 및 농축됩니다. 일반적으로 최대 5라운드의 파지 디스플레이가 수행되며, 이 동안 약하게 결합되는 UbV에 대해 강력한 선택 압력이 부과되어 선호도가 높은 파지 디스플레이가 집중되고 풍부해집니다. 궁극적으로, 그들의 야생형 대조제 보다는 표적 단백질에 대한 더 높은 특이성 및/또는 친화성을 입증하는 UbV는 격리되고 추가 실험을 통해 특징화될 수 있다.
Introduction
단백질-단백질 상호 작용의 분자 세부 사항을 이해하는 것은 생물학적 과정의 신호 변환 메커니즘, 특히 임상적으로 중요한 질병에 기여하는 신호를 파기하는 데 중요합니다. 최근 몇 년 동안 파지 디스플레이는 단백질/펩티드를 원하는 표적 단백질에 훨씬 개선된 결합으로 분리하는 실용적이고 접근 가능한 방법으로 활용되어 왔으며, 이는 단백질 단백질 상호작용의 세포내 프로브로서 사용될 수 있다.
유비퀴티닝은 유비퀴틴(Ub)을 단백질 기판에 곱하게 결합하여 분해또는 세포 신호 변화를 중재하는 효소 활동(E1 활성화 효소 → E2 컨쥬게이팅 효소 → E3 리게아제)의 폭포입니다. 또한, deubiquitinases 단백질에서 유비퀴틴의 제거를 촉매. 따라서, 세포에서는, Ub 의존적인 단백질 단백질 상호 작용의 수천이 있습니다, 대다수는 크고 다양한 표면을 통해 약한 상호 작용을 허용하는 낮은 친화성 그러나 높은 특이성을 가진 일반적인 표면을 인식합니다.
Ernst et al.은 여전히 높은 선택성을 유지하면서 관심있는 단백질에 대한 결합 친화성을 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 Ub의 알려진 결합 영역으로 돌연변이를 도입했습니다5. 알려진 Ub-protein 상호 작용을 중재하는 Ub 표면의 위치에서 돌연변이가 있는 100억 개 이상의 (7.5 x 1010) Ub 변이체(UbV)의 결합 라이브러리가 개발되었습니다. 이 라이브러리는 다양한 UbV에 융합된 M13 박테리오파지 pIII 코트 단백질을 표현하는 파지미드로 구성되었습니다. 따라서, 개별 UbV는 발현 시 코트 단백질을 통해 파지 표면에 표시될 수 있다. 선택 과정에서, 대상 단백질과 상당한 결합 상호 작용을 가진 UbV를 표시하는 파지는 파지 디스플레이의 후속 라운드에서 유지되고 풍부하게 되는 반면, 대상 단백질에 제대로 결합되지 않는 UbV를 표시하는 파지는 파지 풀에서 세척되고 제거됩니다. 유지된 파지 입자는 표시된 UbV에 해당하는 파지미드를 함유하고 있어 한 번 격리된 후 시퀀싱되고 더 많은 특징을 가할 수 있습니다.
이 단백질 엔지니어링 전략을 사용하여, UbV 억제제는 인간 deubiquitinases5 및 바이러스 성 proteases6를 위해 개발되었습니다. 중요한 것은, 우리는 E2 결합 사이트를 납치하고 HECT 도메인7에 Ub 결합 외사이트를 차지하는 UbV를 활성화하여 인간 HECT 가족 E3 리그효소에 대한 억제 UbV를 생성했습니다7. 또한 E2 결합 부위를 대상으로 단황 링 패밀리 E3s를 억제하고 UbV 이압을 유도하여 동종 형 링 E3s8을 활성화할 수 있습니다. 다중 서브유닛 링 E3의 경우, UbV는 링 하위 유닛(예: APC/C 복합체9)을 타겟팅하거나 복잡한 형성(예: SCF E3s10)을 방해하여 억제를 달성할 수 있다. UbV는 UB-proteasome 시스템(UPS)에서 단백질-단백질 상호 작용을 체계적으로 심문하여 UPS 효소의 생화학 적 메커니즘을 더 잘 해독하고 치료 개입을 위한 기능적 부위를 식별하고 검증할 수 있도록 활용할 수 있습니다.
다음 프로토콜은 이전에 생성된 파지를 사용하여 관심 있는 단백질을 타겟팅하는 방법과 연속적인 파지 디스플레이를 통해 대상 단백질과 상호 작용하는 UbV 바인더를 풍부하게 하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
2.1 단계 (단백질 제제)에서 언급했듯이, 다양한 방법으로 단백질 농도를 평가할 수 있으며, 각 방법은 파지 디스플레이에 사용되는 특정 표적 단백질에 기초하여 독특한 이점과 단점을 가질 것이다. 인기 있는 메서드에 대 한 자세한 설명 및 프로토콜의 소스는 이전에 제공 되었습니다11.
후속 라운드에 대한 입력으로 파지 디스플레이의 이전 라운드에 의해 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유비퀴틴 변종 기술은 닥터 Sachdev Sidhu (토론토 대학)의 실험실에서 고안되었습니다. WZ는 현재 인간 및 미생물군유전체 프로그램의 CIFAR 아즈리엘리 글로벌 학자입니다. 이 연구는 WZ (RGPIN-2019-05721)에 수여 NSERC 디스커버리 보조금에 의해 투자되었다.
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
Referências
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