שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3
Summary
בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ‘ כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.
Abstract
אוביקיטין הוא חלבון קטן 8.6 kDa המהווה מרכיב הליבה של מערכת ubiquitin-proteasome. כתוצאה מכך, זה יכול להיקשר למגוון רחב של חלבונים עם ספציפיות גבוהה אבל זיקה נמוכה. באמצעות תצוגת פאג’, ניתן להנדס גרסאות אוביקוויטין (UbVs) כך שהן מציגות זיקה משופרת לכלוביקוויטין של סוג בר ושומרות על ייחודיות מחייבת לחלבונים ממוקדים. תצוגת Phage משתמשת בספריית phagemid, לפיה חלבון מעיל pIII של בקטריופאג M13 חוטי (נבחר מכיוון שהוא מוצג חיצונית על פני הפאג ‘) מותך עם UbVs. שאריות ספציפיות של אוביקוויטין wildtype אנושי הם רכים ואקראיים (כלומר, יש הטיה כלפי רצף wildtype מקומי) כדי ליצור UbVs, כך שינויים מזיקים קונפורמציה חלבון נמנעים תוך הצגת המגוון הדרוש לקידום אינטראקציות חדשניות עם חלבון היעד. במהלך תהליך תצוגת הפאג’, UbVs אלה באים לידי ביטוי ומוצגים על חלבוני מעיל פאג’ ומוצמדים לחלבון בעל עניין. UbVs המציגים אינטראקציות מחייבות חיוביות עם חלבון היעד נשמרים, ואילו קלסרים עניים נשטפים ומוסרים ממאגר הספרייה. ה-UbVs השמורים, המחוברים לחלקיק הפאג’ המכיל את הפאגמיד המקביל של ה-UbV, הם מנוטרלים, מוגברים ומרוכזים, כך שניתן יהיה להצמיד אותם לחלבון היעד בסבב נוסף של תצוגת פאג’. בדרך כלל, עד חמישה סיבובים של תצוגת פאג’, שבמהלכם מופעל לחץ בחירה חזק על UbVs שנקשרים בצורה חלשה ו/או מופקרת, כך שאלו עם זיקה גבוהה יותר מרוכזים ומועשרים. בסופו של דבר, UbVs המדגימים ספציפיות גבוהה יותר ו/או זיקה לחלבון היעד מאשר עמיתיהם בסוג הבר מבודדים וניתן לאפייןם באמצעות ניסויים נוספים.
Introduction
הבנת הפרטים המולקולריים של אינטראקציות חלבון-חלבון היא קריטית לתיווג מנגנוני התמרת האות של תהליכים ביולוגיים, במיוחד אלה התורמים למחלות חשובות מבחינה קלינית. בשנים האחרונות, תצוגת פאג’ נוצלה כשיטה מעשית ונגישה לבידוד חלבונים/פפטידים עם קשירה משופרת בהרבה לחלבון היעד הרצוי1,2,3,4, אשר בתורו יכול לשמש כגשושיות תאיות של אינטראקציות חלבון-חלבון.
בכל מקום הוא מפל של פעילויות אנזימטיות (E1 הפעלת אנזים → E2 ההטיה אנזים → E3 ליגות) כי covalenting ubiquitin (Ub) כדי למקד אותם עבור השפלה או לתווך שינויים איתות התא. בנוסף, deubiquitinases לזרז את הסרת אוביקיטין חלבונים. לכן, בתאים, יש אלפי אינטראקציות חלבון תלויות Ub, שרובן המכריע מזהות משטח משותף עם זיקה נמוכה אך ספציפיות גבוהה כדי לאפשר אינטראקציות חלשות דרך משטחים גדולים ומגוונים.
ארנסט ואח ‘ הציג מוטציות לתוך אזורים מחייבים ידועים של Ub על מנת לראות אם הם יכולים לשפר את הזיקה מחייבת עבור חלבון של עניין תוך שמירה על סלקטיביות גבוהה5. פותחה ספרייה קומבינטורית של יותר מ-10 מיליארד (7.5 x 1010) גרסאות Ub (UbVs) עם מוטציות בעמדות על פני השטח של Ub המתווכות את האינטראקציות הידועות של חלבון Ub. ספרייה זו כללה פאגמידים המבטאים את חלבון מעיל ה-M13 pIII הותוך ל-UbVs מגוונים. לכן, UbVs בודדים ניתן להציג על משטח phage באמצעות חלבון המעיל על הביטוי. במהלך תהליך הבחירה, פאג’ המציג UbVs עם אינטראקציות מחייבות ניכרות עם חלבון היעד יישמר ויועשר בסבבים הבאים של תצוגת פאג’, בעוד ש-UbVs המציגים UbVs שנקשרים בצורה גרועה לחלבון היעד נשטפים ומוסרים ממאגר הפאג’. חלקיקי הפאג’ השמורים מכילים את הפאגמיד המתאים ל-UbV המוצג שלהם, ומאפשרים להם להיות רצפים ומאופיין עוד יותר לאחר בידודם.
באמצעות אסטרטגיה זו הנדסת חלבונים, מעכבי UbV פותחו עבור deubiquitinases אנושי5 ופרוטאזים ויראליים6. חשוב לציין, יצרנו UbVs מעכב עבור 3 רצועות E3 משפחתי HECT אנושי באמצעות חטיפת אתר כריכת E2 והפעלת UbVs שתופסים אקסוסיט מחייב Ub בתחום HECT7. אנחנו יכולים גם לעכב E3s מונומרי RING-המשפחה על ידי מיקוד אתר כריכת E2 ולעורר דימרציה UbV להפעיל הומודימרי RING E3s8. עבור RING E3s מרובת תת-יחידות, UbVs יכולים להשיג עיכוב על-ידי מיקוד של subunit RING (לדוגמה, עבור קומפלקס APC/C9) או שיבוש היווצרות מורכבת (לדוגמה, עבור SCF E3s10). באופן קולקטיבי, ניתן למנף UbVs כדי לחקור באופן שיטתי אינטראקציות חלבון-חלבון במערכת Ub-proteasome (UPS) כדי שנוכל לפענח טוב יותר מנגנונים ביוכימיים של אנזימי UPS ולזהות ולאמת אתרים פונקציונליים להתערבות טיפולית.
הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להשתמש בספריית UbV שהוצגה בעבר כדי למקד חלבון מעניין וכיצד להעשיר את קלסרי UbV שמתקשרים עם חלבון היעד באמצעות סיבובים רצופים של תצוגת פאג ‘.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שצוין בשלב 2.1 (הכנת חלבון), ניתן להשתמש במגוון שיטות להערכת ריכוז החלבון, ולכל אחת מהן יהיו יתרונות וחסרונות ייחודיים המבוססים על חלבון היעד הספציפי המשמש לתצוגת פאג’. בעבר סופק מקור לתיאורים ופרוטוקולים מפורטים עבור שיטות פופולריות.
השימוש בפאג’ שנשמר על יד…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טכנולוגיית וריאנט אוביקוויטין הומצאה במעבדה של ד”ר סצ’דב סידו (אוניברסיטת טורונטו). WZ הוא כיום חוקרת גלובלית של CIFAR עזריאלי בתוכנית בני האדם והמיקרוביום. מחקר זה מומן על ידי מענקי דיסקברי NSERC שהוענקו ל- WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
Referências
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Bioquímica. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display–an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
