Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Summary

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Abstract

Ubiquitin é uma pequena proteína de 8,6 kDa que é um componente central do sistema ubiquitin-proteasome. Consequentemente, pode se ligar a uma variedade diversificada de proteínas com alta especificidade, mas baixa afinidade. Através do display de phage, as variantes de ubiquitina (UbVs) podem ser projetadas de tal forma que exibem maior afinidade sobre a ubiquitina wildtype e mantêm a especificidade de ligação às proteínas-alvo. O display phage utiliza uma biblioteca phagemid, pela qual a proteína pIII coat de um bacteriophage m13 filamentoso (escolhido porque é exibido externamente na superfície da praga) é fundido com UbVs. Resíduos específicos do tipo selvagem humano ubiquitin são macios e randomizados (ou seja, há um viés em relação à sequência de tipo silvestre nativo) para gerar UbVs para que mudanças deletérias na conformação proteica sejam evitadas ao introduzir a diversidade necessária para promover novas interações com a proteína alvo. Durante o processo de exibição de phage, esses UbVs são expressos e exibidos em proteínas de revestimento de phage e garimpados contra uma proteína de interesse. Os UbVs que exibem interações vinculantes favoráveis com a proteína alvo são retidos, enquanto os aglutinantes pobres são lavados e removidos da piscina da biblioteca. Os UbVs retidos, que são anexados à partícula de phage contendo o phagemid correspondente da UbV, são elucidos, amplificados e concentrados para que possam ser garimpados contra a mesma proteína alvo em outra rodada de exibição de phage. Normalmente, são realizadas até cinco rodadas de exibição de phage, durante as quais uma forte pressão de seleção é imposta contra UbVs que se ligam fracamente e/ou promiscuamente para que aqueles com maiores afinidades sejam concentrados e enriquecidos. Em última análise, os UbVs que demonstram maior especificidade e/ou afinidade com a proteína alvo do que suas contrapartes do tipo selvagem são isolados e podem ser caracterizados através de outros experimentos.

Introduction

Compreender os detalhes moleculares das interações proteína-proteína é fundamental para delinear os mecanismos de transdução de sinais dos processos biológicos, particularmente aqueles que contribuem para doenças clinicamente importantes. Nos últimos anos, a exposição phage tem sido utilizada como um método prático e acessível para isolar proteínas/peptídeos com uma ligação muito melhor a uma proteína alvo ^{desejada1,2,3,4}, que por sua vez pode ser usada como sondas intracelulares de interações proteína-proteína.

A ubiquização é uma cascata de atividades enzimáticas (E1 ativando enzima → enzima conjugadora E2 → ligases E3) que conjugam covalentemente a ubiquitina (Ub) para substratos proteicos para direcioná-los para degradação ou para mediar as alterações de sinalização celular. Além disso, as deubiquitinas catalisam a remoção da ubiquitina das proteínas. Portanto, nas células, há milhares de interações proteína-proteína dependentes de Ub, a grande maioria das quais reconhecem uma superfície comum com baixa afinidade, mas alta especificidade para permitir interações fracas através de grandes e diversas superfícies.

Ernst et al. introduziram mutações em regiões de ligação conhecidas da Ub, a fim de ver se eles poderiam aumentar a afinidade vinculante para uma proteína de interesse, mantendo ainda alta ^{seletividade5}. Uma biblioteca combinatória de mais de 10 bilhões (7,5 x ¹⁰¹⁰) variantes ub (UbVs) com mutações em posições em toda a superfície Ub que mediam as conhecidas interações ub-proteína foi desenvolvida. Esta biblioteca consistia de phagemides que expressam a proteína m13 bacteriophage pIII coat fundida a UbVs diversificadas. Portanto, UbVs individuais podem ser exibidos na superfície da praga através da proteína do casaco após a expressão. Durante o processo de seleção, phage que exibe UbVs com considerável interações vinculantes com a proteína alvo será retido e enriquecido em rodadas subsequentes de exibição de phage, enquanto phage exibindo UbVs que se ligam mal à proteína alvo são lavados e removidos da piscina de phage. As partículas de phage retidas contêm o phagemid correspondente ao seu UbV exibido, permitindo que sejam sequenciados e ainda mais caracterizados uma vez isolados.

Utilizando esta estratégia de engenharia proteica, os inibidores de UbV foram desenvolvidos para deubiquitinases ^humanas5 e proteases ⁶ virais. É importante ressaltar que geramos UbVs inibitórios para ligaduras E3 da família HECT humana através do sequestro do site de ligação E2 e ativação de UbVs que ocupam um exosite ub-vinculante no domínio ^HECT7. Também podemos inibir e3s monoméricas da família RING mirando o site de ligação E2 e induzir a dimerização ubV para ativar o HOMOdimeric RING ^E3s8. Para vários E3s ring multi-subunidades, os UbVs podem alcançar a inibição mirando a subunidade RING (por exemplo, para complexo APC/^C9) ou interrompendo a formação complexa (por exemplo, para SCF ^E3s10). Coletivamente, os UbVs podem ser aproveitados para interrogar sistematicamente interações proteína-proteína no sistema Ub-proteasome (UPS) para que possamos decifrar melhor os mecanismos bioquímicos das enzimas UPS e identificar e validar locais funcionais para intervenção terapêutica.

O protocolo a seguir descreve como empregar uma biblioteca ubV exibida anteriormente para atingir uma proteína de interesse e como enriquecer as pastas UbV que interagem com a proteína alvo através de sucessivas rodadas de exibição de phage.

Protocol

1. Preparação do reagente PBS (salina tampão fosfato): Misture 50 mL de solução PBS de 10x com 450 mL de ultrapure H2O. Esterilizar por filtragem e armazenar a 4 °C ou temperatura ambiente (~20-25 °C). 10% BSA (albumina de soro bovino): Adicione lentamente 1 g de BSA a 7 mL de H2O ultrapure e misture até dissolver totalmente (sem aglomerados). Cubra com H2O ultrauso até que o volume final seja de 10 mL. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C. Ta…

Representative Results

As pastas produzidas a partir do display phage podem ser verificadas e analisadas de muitas maneiras. Recomenda-se primeiro proceder com o sequenciamento do phage com primers que flanqueiam a inserção diversificada na biblioteca phagemid. Um experimento ideal de exibição de phage mostrará um viés claro em relação a várias sequências (Figura 1). Outras sequências também estarão presentes, mas com uma contagem mais baixa, aparecendo mais como ruído de fundo. No exemplo fornecido,…

Discussion

Como mencionado na etapa 2.1 (preparação de proteínas), uma variedade de métodos pode ser usado para avaliar a concentração de proteínas, e cada um terá benefícios e desvantagens únicas com base na proteína alvo específica usada para exibição de phage. Uma fonte de descrições detalhadas e protocolos para métodos populares foi fornecida ^{anteriormente11}.

O uso do phage retido por uma rodada anterior de exibição de phage como a entrada para uma rodada su…

Materials

Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.