Använda Phage Display för att utveckla Ubiquitin Variant Modulators för E3 Ligases

Summary

Ubiquitination är ett kritiskt protein post-translationell modifiering, vars dysregulation har varit inblandad i många mänskliga sjukdomar. Detta protokoll beskriver hur display kan användas för att isolera nya ubiquitin varianter som kan binda och modulera aktiviteten hos E3 ligases som styr specificitet, effektivitet och mönster av allestädes närvarande.

Abstract

Ubiquitin är ett litet 8,6 kDa-protein som är en kärnkomponent i ubiquitin-proteasomsystemet. Följaktligen kan det binda till en mängd olika proteiner med hög specificitet men låg affinitet. Genom display, ubiquitin varianter (UbVs) kan konstrueras så att de uppvisar förbättrad affinitet över wildtype ubiquitin och upprätthålla bindande specificitet att mål proteiner. Phage display använder ett fagemidbibliotek, varigenom pII-pälsproteinet hos en filamentös M13-bakteriofag (vald eftersom den visas externt på fagytan) smälts samman med UbVs. Specifika rester av humant wildtype ubiquitin är mjuka och randomiserade (dvs. det finns en förspänning mot infödd vildtypssekvens) för att generera UbVs så att skadliga förändringar i proteinkonformation undviks samtidigt som den mångfald som krävs för att främja nya interaktioner med målproteinet. Under fagvisningsprocessen uttrycks och visas dessa UbVs på fagrockproteiner och panoreras mot ett protein av intresse. BubVs som uppvisar gynnsamma bindningsinteraktioner med målproteinet behålls, medan dåliga bindemedel tvättas bort och tas bort från bibliotekspoolen. De kvarhållna UbVs, som är fästa vid fagpartikeln som innehåller UbV: s motsvarande fagemid, eltas, förstärks och koncentreras så att de kan panoreras mot samma målprotein i en annan omgång fagdisplay. Vanligtvis utförs upp till fem rundor av fagdisplay, under vilken ett starkt urvalstryck införs mot UbVs som binder svagt och / eller promiskuöst så att de med högre affiniteter koncentreras och berikas. I slutändan isoleras UbVs som visar högre specificitet och/eller affinitet för målproteinet än deras vilda typ motsvarigheter och kan karakteriseras genom ytterligare experiment.

Introduction

Att förstå de molekylära detaljerna i protein-proteininteraktioner är avgörande för att avgränsa signaltransduktionsmekanismerna i biologiska processer, särskilt de som bidrar till kliniskt viktiga sjukdomar. Under de senaste åren har faagedisplay använts som en praktisk och tillgänglig metod för att isolera proteiner/peptider med mycket förbättrad bindning till önskat målprotein1,2,3,4, som i sin tur kan användas som intracellulära sonder av protein-proteininteraktioner.

Ubiquitination är en kaskad av enzymatiska aktiviteter (E1-aktiverande enzym → E2 konjugerande enzym → E3 ligaser) som kovalent konjugerar ubiquitin (Ub) till proteinsubstrat för att rikta dem mot nedbrytning eller för att medla cellsignaleringsförändringar. Dessutom katapulterar deubiquitinaser avlägsnandet av ubiquitin från proteiner. Därför finns det i celler tusentals Ub-beroende protein-proteininteraktioner, varav de allra flesta känner igen en gemensam yta med låg affinitet men hög specificitet för att tillåta svaga interaktioner genom stora och olika ytor.

Ernst et al. introducerade mutationer i kända bindande regioner i Ub för att se om de kunde förbättra bindande affinitet för ett protein av intresse samtidigt som hög ^{selektivitet5} bibehålls. Ett kombinatoriskt bibliotek med över 10 miljarder (7,5 x ¹⁰¹⁰) Ub-varianter (UbVs) med mutationer på positioner över Ub-ytan som förmedlar de kända Ub-proteininteraktionerna utvecklades. Detta bibliotek bestod av fagemider som uttrycker M13 bakteriofag pII kappa protein smält till diversifierade UbVs. Därför kan enskilda UbVs visas på fagytan via pälsproteinet vid uttryck. Under urvalsprocessen kommer som visar UbVs med betydande bindande interaktioner med målproteinet att behållas och berikas i efterföljande rundor, medan som visar UbVs som binder dåligt till målproteinet tvättas bort och avlägsnas från fagpoolen. De balanserade fagpartiklarna innehåller fagemid som motsvarar deras visade UbV, så att de kan sekvenseras och ytterligare karakteriseras när de isolerats.

Med hjälp av denna proteinteknikstrategi utvecklades UbV-hämmare för mänskliga deubiquitinases5 och virala proteaser6. Viktigt är att vi har genererat hämmande UbVs för mänskliga HECT-familjen E3 ligases genom kapning av E2-bindande webbplats och aktivera UbVs som upptar en Ub-bindande exosite på HECT-domänen7. Vi kan också hämma monomeriska RING-familjen E3s genom att rikta in oss på E2-bindningsstället och inducera UbV dimerization för att aktivera homodimeric RING ^E3s8. För flerdelad RING E3s kan UbVs uppnå hämning genom att rikta in sig på RING-underenheten (t.ex. för APC/C-komplex9) eller störa komplex bildning (t.ex. för SCF E3s10). Tillsammans kan UbVs utnyttjas för att systematiskt förhöra protein-proteininteraktioner i Ub-proteasome-systemet (UPS) så att vi bättre kan dechiffrera biokemiska mekanismer av UPS-enzymer och för att identifiera och validera funktionella platser för terapeutisk intervention.

Följande protokoll beskriver hur man använder ett tidigare genererat som visats UbV-bibliotek för att rikta in sig på ett protein av intresse och hur man berikar de UbV-bindemedel som interagerar med målproteinet genom successiva rundor av fagdisplay.

Protocol

1. Reagensberedning PBS (fosfatbuffrad saltlösning): Blanda 50 ml 10x PBS-lösning med 450 ml ultrapur H2O. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C eller rumstemperatur (~20-25 °C). 10% BSA (bovint serumalbumin): Tillsätt långsamt 1 g BSA till 7 ml ultrapure H2O och blanda tills det är helt upplöst (inga klumpar). Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 10 ml. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C. PB-buffert …

Representative Results

Bindemedel som produceras från fagdisplay kan verifieras och analyseras på många sätt. Det rekommenderas att först fortsätta med sekvensering av med primers som flankerar den diversifierade insatsen i fagemidbiblioteket. Ett idealiskt fagdisplayexperiment visar en tydlig förspänning mot flera sekvenser (bild 1). Andra sekvenser kommer också att finnas men med ett lägre antal, som visas mer som bakgrundsljud. I exemplet som tillhandahålls, där fagvisning utfördes mellan ubiquitin…

Discussion

Som nämns i steg 2.1 (proteinpreparat) kan en mängd olika metoder användas för att bedöma proteinkoncentrationen, och var och en kommer att ha unika fördelar och nackdelar baserat på det specifika målprotein som används för fagdisplay. En källa till detaljerade beskrivningar och protokoll för populära metoder har tidigare ^{tillhandahållits11}.

Att använda fagen som behålls av en tidigare omgång fagdisplay som inmatning för en efterföljande runda berikar…

Materials

Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.