E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma
Summary
Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Abstract
Ubiquitin, ubiquitin-proteazom sisteminin temel bir bileşeni olan küçük bir 8.6 kDa proteinidir. Sonuç olarak, yüksek özgüllüğe ancak düşük benzeşime sahip çeşitli proteinler dizisine bağlanabilir. Faj ekranı sayesinde, ubiquitin varyantları (UbV’ler) wildtype ubiquitin üzerinde gelişmiş benzeşim gösterecek ve hedef proteinlere bağlayıcı özgüllüğü koruyacak şekilde geliştirilebilir. Faj ekranı, filamentli bir M13 bakteriyofajının pIII kat proteininin (faj yüzeyinde harici olarak görüntülendiği için seçilir) UbV’lerle kaynaştırıldığı bir fajmid kütüphanesi kullanır. İnsan wildtype ubiquitin’in spesifik kalıntıları yumuşak ve randomizedir (yani, yerel wildtype dizisine karşı bir önyargı vardır), böylece hedef proteinle yeni etkileşimleri teşvik etmek için gerekli çeşitliliği tanıtırken protein uyumundaki zararlı değişikliklerden kaçınılır. Faj görüntüleme işlemi sırasında, bu UbV’ler faj kat proteinleri üzerinde ifade edilir ve görüntülenir ve ilgi çekici bir proteine karşı tavalanır. Hedef proteinle olumlu bağlayıcı etkileşimler gösteren UBV’ler korunurken, zayıf bağlayıcılar yıkanır ve kütüphane havuzundan çıkarılır. UbV’nin karşılık gelen fajmidini içeren faj parçacığına bağlı tutulan UbV’ler, başka bir faj ekranında aynı hedef proteine karşı panned edilebilmeleri için eluted, amplified ve konsantre edilir. Tipik olarak, beş adede kadar faj ekranı gerçekleştirilir ve bu sırada zayıf ve/veya karışık bir şekilde bağlanan UBV’lere karşı güçlü bir seçim baskısı uygulanır, böylece daha yüksek yakınlıkları olanlar konsantre edilir ve zenginleştirilir. Sonuç olarak, hedef protein için wildtype meslektaşlarından daha yüksek özgüllük ve/veya benzeşim gösteren UbV’ler izole edilir ve daha fazla deneyle karakterize edilebilir.
Introduction
Protein-protein etkileşimlerinin moleküler ayrıntılarını anlamak, özellikle klinik olarak önemli hastalıklara katkıda bulunan biyolojik süreçlerin sinyal transdüksiyon mekanizmalarını suçlu bulmak için kritik öneme sahiptir. Son yıllarda, faj görüntüleme, protein-protein etkileşimlerinin hücre içi probları olarak kullanılabilen istenen bir hedef proteine çok daha iyi bağlanmış proteinleri / peptitleri izole etmek için pratik ve erişilebilir bir yöntem olarak kullanılmaktadır1,2,3,4.
Ubiquitination, ubiquitin’i (Ub) bozulma veya hücre sinyal değişikliklerine aracılık etmek için protein substratlarına kovalent olarak eşleyen enzimatik faaliyetlerin (E1 aktive enzim → E2 konjugating enzimi → E3 ligazyonları) bir çağlayanıdır. Ek olarak, deubiquitinases, ubiquitin’in proteinlerden uzaklaştırılmasını katalİze eder. Bu nedenle, hücrelerde, büyük çoğunluğu büyük ve çeşitli yüzeylerde zayıf etkileşimlere izin vermek için düşük benzeşimli ancak yüksek özgüllüğe sahip ortak bir yüzeyi tanıyan binlerce Ub bağımlı protein-protein etkileşimi vardır.
Ernst ve arkadaşları, Ub’in bilinen bağlayıcı bölgelerine mutasyonlar getirdi ve hala yüksek seçiciliği korurken ilgi çekici bir protein için bağlayıcı yakınlığı artırıp artıramayacağını görmek için5. Bilinen Ub-protein etkileşimlerine aracılık eden Ub yüzeyindeki pozisyonlarda mutasyonlara sahip 10 milyardan fazla (7,5 x 1010) Ub varyantından (UbV) oluşan bir kombinatoryal kütüphane geliştirildi. Bu kütüphane, çeşitlendirilmiş UbV’lere kaynaşmış M13 bakteriyofaj pIII kat proteinini ifade eden fajmidlerden oluşuyordu. Bu nedenle, bireysel UbV’ler ifade üzerine kat proteini aracılığıyla faj yüzeyinde görüntülenebilir. Seçim sürecinde, hedef proteinle önemli bağlayıcı etkileşimlere sahip UbV’leri görüntüleyen fajlar sonraki faj görüntüleme turlarında tutulacak ve zenginleştirilecek, hedef proteine zayıf bağlanan UbV’leri gösteren faj ise yıkanarak faj havuzundan çıkarılacaktır. Tutulan faj parçacıkları, görüntülenen UbV’lerine karşılık gelen fajmidi içerir ve izole edildikten sonra sıralanmalarını ve daha fazla karakterize olmalarını sağlar.
Bu protein mühendisliği stratejisi kullanılarak, UbV inhibitörleri insan deubiquitinases5 ve viral proteazes6 için geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, E2-bağlama sitesini ele geçirerek ve HECT etki alanında Ub bağlayıcı bir dış kaplamayı işgal eden UbV’leri etkinleştirerek insan HECT ailesi E3 bağları için inhibitör UbV’ler oluşturduk7. Ayrıca E2 bağlama bölgesini hedefleyerek monomerik RING ailesi E3’leri inhibe edebilir ve homodimerik RING E3s8’i etkinleştirmek için UbV dimerizasyonunu teşvik edebiliriz. Çok alt üne sahip RING E3’ler için, UbV’ler RING alt birimini (örneğin, APC/C kompleksi9 için) hedef alarak veya karmaşık oluşumu bozarak (örneğin, SCF E3s10 için) inhibisyon elde edebilir. Toplu olarak, UbV’ler, Ub-proteazom sistemindeki (UPS) protein-protein etkileşimlerini sistematik olarak sorgulamak için kullanılabilir, böylece UPS enzimlerinin biyokimyasal mekanizmalarını daha iyi deşifre edebilir ve terapötik müdahale için fonksiyonel bölgeleri belirleyebilir ve doğrulayabiliriz.
Aşağıdaki protokol, ilgi çekici bir proteini hedeflemek için daha önce oluşturulmuş bir faj görüntülenen UbV kütüphanesinin nasıl kullanılacağını ve ardışık faj görüntüleme turları aracılığıyla hedef proteinle etkileşime giren UbV bağlayıcılarının nasıl zenginleştirilerek zenginleştirilmeyi açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adım 2.1’de (protein hazırlama) belirtildiği gibi, protein konsantrasyonunu değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve her birinin faj görüntüleme için kullanılan belirli hedef proteine dayanarak benzersiz yararları ve dezavantajları olacaktır. Daha önce popüler yöntemler için ayrıntılı açıklamalar ve protokoller kaynağı sağlanmıştır11.
Sonraki bir tur için giriş olarak önceki bir faj ekranı tarafından tutulan fajı kull…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ubiquitin varyant teknolojisi Dr. Sachdev Sidhu ‘nun (Toronto Üniversitesi) laboratuvarında tasarlanmıştır. WZ şu anda İnsanlar ve Mikrobiyom Programı’nda CIFAR Azrieli Global Scholar’dır. Bu araştırma WZ’ye (RGPIN-2019-05721) verilen NSERC Discovery Grants tarafından finanse edildi.
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
Referências
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Bioquímica. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display–an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
