Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3
Summary
La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.
Abstract
La ubiquitina es una pequeña proteína de 8,6 kDa que es un componente central del sistema ubiquitina-proteasoma. En consecuencia, puede unirse a una amplia gama de proteínas con alta especificidad pero baja afinidad. A través de la visualización de fagos, las variantes de ubiquitina (UbV) pueden diseñarse de tal manera que exhiban una afinidad mejorada sobre la ubiquitina de tipo salvaje y mantengan la especificidad de unión a las proteínas objetivo. La pantalla de fagos utiliza una biblioteca de fagomides, mediante la cual la proteína de la capa pIII de un bacteriófago filamentoso M13 (elegido porque se muestra externamente en la superficie del fago) se fusiona con UbV. Los residuos específicos de ubiquitina de tipo silvestre humano son blandos y aleatorizados (es decir, existe un sesgo hacia la secuencia de tipo silvestre nativo) para generar UbV de modo que se eviten cambios perjudiciales en la conformación de proteínas al tiempo que se introduce la diversidad necesaria para promover nuevas interacciones con la proteína objetivo. Durante el proceso de visualización de fagos, estos UbV se expresan y muestran en las proteínas de la capa de fagos y se comparan con una proteína de interés. Los UbV que exhiben interacciones de unión favorables con la proteína objetivo se conservan, mientras que los aglutinantes pobres se eliminan y se eliminan del grupo de la biblioteca. Los UbV retenidos, que están unidos a la partícula de fago que contiene la fagomida correspondiente del UbV, se eluyen, amplifican y concentran para que puedan ser analizados contra la misma proteína objetivo en otra ronda de visualización de fagos. Por lo general, se realizan hasta cinco rondas de visualización de fagos, durante las cuales se impone una fuerte presión de selección contra ubV que se unen débilmente y / o promiscuamente para que aquellos con afinidades más altas se concentren y enriquezcan. En última instancia, los UbV que demuestran una mayor especificidad y / o afinidad por la proteína objetivo que sus contrapartes de tipo salvaje se aíslan y se pueden caracterizar a través de experimentos adicionales.
Introduction
Comprender los detalles moleculares de las interacciones proteína-proteína es fundamental para delinear los mecanismos de transducción de señales de los procesos biológicos, particularmente aquellos que contribuyen a enfermedades clínicamente importantes. En los últimos años, la visualización de fagos se ha utilizado como un método práctico y accesible para aislar proteínas / péptidos con una unión mucho mejor a una proteína objetivo deseada1,2,3,4, que a su vez se puede utilizar como sondas intracelulares de interacciones proteína-proteína.
La ubiquitinación es una cascada de actividades enzimáticas (enzima activadora de E1 → enzima conjugante E2 → ligasas E3) que conjugan covalentemente ubiquitina (Ub) con sustratos de proteínas para dirigirse a ellos para su degradación o para mediar cambios en la señalización celular. Además, las deubiquitinasas catalizan la eliminación de la ubiquitina de las proteínas. Por lo tanto, en las células, hay miles de interacciones proteína-proteína dependientes de Ub, la gran mayoría de las cuales reconocen una superficie común con baja afinidad pero alta especificidad para permitir interacciones débiles a través de superficies grandes y diversas.
Ernst et al. introdujeron mutaciones en regiones de unión conocidas de Ub para ver si podían mejorar la afinidad de unión por una proteína de interés sin dejar de mantener una alta selectividad5. Se desarrolló una biblioteca combinatoria de más de 10 mil millones (7,5 x 1010) variantes de Ub (UbV) con mutaciones en posiciones a través de la superficie de Ub que median las interacciones conocidas entre la proteína Ub. Esta biblioteca consistía en fagémidas que expresan la proteína de la capa de bacteriófagos M13 pIII fusionada a UbV diversificados. Por lo tanto, los UbV individuales se pueden mostrar en la superficie del fago a través de la proteína de la capa al momento de la expresión. Durante el proceso de selección, los fagos que muestran UbV con interacciones de unión considerables con la proteína objetivo se conservarán y enriquecerán en rondas posteriores de visualización de fagos, mientras que los fagos que muestran UbV que se unen mal a la proteína objetivo se eliminan y eliminan del grupo de fagos. Las partículas de fagos retenidos contienen el fagamida correspondiente a su UbV mostrado, lo que les permite ser secuenciadas y caracterizadas una vez aisladas.
Utilizando esta estrategia de ingeniería de proteínas, se desarrollaron inhibidores de UbV para deubiquitinasas humanas5 y proteasas virales6. Es importante destacar que hemos generado UbV inhibitorios para ligasas E3 de la familia HECT humanas a través del secuestro del sitio de unión a E2 y la activación de UbVs que ocupan un exosito de unión a Ub en el dominio HECT7. También podemos inhibir los E3 monoméricos de la familia RING dirigiéndonos al sitio de unión E2 e inducir la dimerización de UbV para activar el ANILLO homodimérico E3s8. Para los RING E3 de subunidades múltiples, los UbV pueden lograr la inhibición dirigiéndose a la subunidad RING (por ejemplo, para el complejo APC/C9) o interrumpiendo la formación de complejos (por ejemplo, para SCF E3s10). Colectivamente, los UbV se pueden aprovechar para interrogar sistemáticamente las interacciones proteína-proteína en el sistema Ub-proteasoma (UPS) para que podamos descifrar mejor los mecanismos bioquímicos de las enzimas UPS e identificar y validar sitios funcionales para la intervención terapéutica.
El siguiente protocolo describe cómo emplear una biblioteca de UbV mostrada de fagos previamente generada para apuntar a una proteína de interés y cómo enriquecer los aglutinantes de UbV que interactúan con la proteína objetivo a través de rondas sucesivas de visualización de fagos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se mencionó en el paso 2.1 (preparación de proteínas), se puede utilizar una variedad de métodos para evaluar la concentración de proteínas, y cada uno tendrá beneficios e inconvenientes únicos basados en la proteína objetivo específica utilizada para la visualización de fagos. Anteriormente se ha proporcionado una fuente de descripciones y protocolos detallados para métodos populares11.
El uso del fago retenido por una ronda anterior de visualización …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La tecnología de variante de ubiquitina fue ideada en el laboratorio del Dr. Sachdev Sidhu (Universidad de Toronto). WZ es actualmente un CIFAR Azrieli Global Scholar en el Programa de Humanos y Microbioma. Esta investigación fue financiada por NSERC Discovery Grants otorgada a WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
Referências
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