Modèle de saignement par transsection veineuse de la queue chez des souris hémophiliques A entièrement anesthésiées

Summary

Le modèle de saignement par transsection de la veine caudale raffinée (TVT) chez les souris anesthésiées est une méthode in vivo sensible pour l’évaluation des saignements hémophiles. Ce modèle de saignement TVT optimisé utilise la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation, affinant d’autres modèles et évitant la mort comme critère d’évaluation.

Abstract

Les modèles de saignement de la queue sont des outils importants dans la recherche sur l’hémophilie, en particulier pour l’évaluation des effets du procoagulant. Le modèle de survie par transsection de la veine caudale (TVT) a été préféré dans de nombreux contextes en raison de la sensibilité aux doses cliniquement pertinentes de FVIII, tandis que d’autres modèles établis, tels que le modèle du clip de la queue, nécessitent des niveaux plus élevés de composés procoagulants. Pour éviter d’utiliser la survie comme critère d’évaluation, nous avons développé un modèle TVT établissant la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation et d’anesthésie complète pendant toute l’expérience. En bref, les souris anesthésiées sont positionnées avec la queue immergée dans une solution saline tempérée (37 ° C) et dosées avec le composé d’essai dans la veine latérale droite de la queue. Après 5 min, la veine latérale gauche de la queue est transectée à l’aide d’un guide modèle, la queue est retournée à la solution saline et tous les épisodes de saignement sont surveillés et enregistrés pendant 40 minutes tout en recueillant le sang. Si aucun saignement ne se produit à 10 min, 20 min ou 30 min après la blessure, le caillot est remis en question doucement en essuyant la coupe deux fois avec un tampon de gaze humide. Après 40 minutes, la perte de sang est quantifiée par la quantité d’hémoglobine saignée dans la solution saline. Cette procédure rapide et relativement simple se traduit par des saignements cohérents et reproductibles. Par rapport au modèle de survie TVT, il utilise une procédure plus humaine sans compromettre la sensibilité à l’intervention pharmacologique. En outre, il est possible d’utiliser les deux sexes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux à élever, conformément aux principes des 3R. Une limitation potentielle dans les modèles de saignement est la nature stochastique de l’hémostase, qui peut réduire la reproductibilité du modèle. Pour contrer cela, la perturbation manuelle du caillot garantit que le caillot est remis en question pendant la surveillance, empêchant l’hémostase primaire (plaquette) d’arrêter le saignement. Cet ajout au catalogue de modèles de lésions hémorragiques offre une option pour caractériser les effets du procoagulant de manière standardisée et humaine.

Introduction

Les modèles animaux sont essentiels pour comprendre la pathogenèse de l’hémophilie et pour développer et tester des schémas thérapeutiques et des thérapies. La souris knock-out de facteur VIII (F8-KO) est un modèle largement utilisé pour l’étude de l’hémophilie A ^1,2. Ces souris récapitulent les principales caractéristiques de la maladie et ont été largement utilisées pour le développement de traitements, tels que les produits recombinants FVIII ^3,4,5 et les stratégies de thérapie génique ^6,7.

Il existe différents modèles de lésions hémorragiques pour évaluer les effets pharmacologiques de différents composés hémostatiques in vivo. L’un de ces modèles de coagulation est le modèle de survie par transsection de la veine caudale chez les souris ^{8,9,10,11,12,13,14}, mesurant la capacité des souris hémophiles à survivre à l’exsanguination après la transsection de la queue. Cette méthode a été introduite il y a plus de quatre décennies¹⁵ et est encore utilisée ^9,16,17. Cependant, le modèle utilise la survie comme critère d’évaluation et nécessite l’observation des animaux sur une période allant jusqu’à 24 heures, au cours de laquelle les animaux sont conscients et peuvent donc ressentir de la douleur et de la détresse.

Des modèles de saignement de plus courte durée et sous anesthésie complète ont été décrits précédemment, tels que le modèle de clip de queue (également connu sous le nom de pointe de la queue)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Néanmoins, pour une normalisation complète de la perte de sang après le défi hémorragique, ces modèles nécessitent des doses de composés procoagulants (par exemple, FVIII) beaucoup plus élevées que celles administrées cliniquement²⁹. Un modèle de blessure différent sous anesthésie, la méthode de saignement vena saphena, est sensible à des doses plus faibles de composés procoagulants³⁰, mais nécessite un niveau élevé d’intervention de l’expérimentateur car les caillots doivent être perturbés fréquemment (par opposition à 3 fois dans le modèle présenté).

La normalisation vers un protocole commun pour tester de nouveaux composés procoagulants faciliterait grandement la comparaison des données entre les laboratoires 31,32,33. Dans les modèles TVT, il n’y a pas encore d’accord commun sur les critères d’évaluation étudiés (perte de sang ^7,26, temps de saignement ^9,34 et taux de survie^35,36), et la durée expérimentale varie entre les études¹³.

Notre objectif principal est de décrire et de caractériser un modèle optimisé avec une reproductibilité élevée, la possibilité d’étudier à la demande ainsi qu’un traitement prophylactique, la sensibilité à l’intervention pharmacologique équivalente au modèle de survie, mais sans utiliser la mort ou la mort imminente comme critères d’évaluation. Afin de réduire la douleur et la détresse, les animaux ne doivent pas être conscients pendant les saignements et un critère d’évaluation plus éthique doit être mis en œuvre³⁷.

Les modèles de clip de queue sont généralement effectués dans l’une des deux variantes, soit en amputant l’extrémité de la queue, par exemple, l’amputation de 1-5 mm ^{18,19,20,21,23,24} ou, dans une variante plus sévère, transecté à un diamètre de queue d’environ 1-3 mm ^8,22,25 . Cela provoque un saignement artérioveineux combiné, car les veines latérales et dorsales et l’artère ventrale sont généralement sectionnées et, en général, plus l’amputation est importante, plus la sensibilité à un composé procoagulant est faible. De plus, comme l’extrémité de la queue est amputée, la blessure artérioveineuse est exposée sans aucun tissu opposé; ainsi, du moins en théorie, il est différent des saignements hémophiles les plus courants.

Comme son nom l’indique, seule la veine est blessée dans les modèles de transsection de la veine caudale tels que décrits dans cet article, entraînant ainsi un saignement exclusivement veineux. Étant donné que le vaisseau n’est pas complètement sectionné, la blessure devrait être plus petite que dans les modèles d’amputation, et le tissu autour de la coupure, auquel un caillot peut adhérer, est conservé. En outre, il y a une pression artérielle plus basse dans la veine par opposition à l’artère. Ces facteurs contribuent à une sensibilité accrue par rapport aux modèles d’amputation, de sorte que la normalisation des saignements peut être obtenue avec des doses cliniquement pertinentes de traitement de remplacement, par exemple avec le rFVIII dans l’hémophilie A, ce qui est utile pour évaluer l’ampleur et la durabilité des effets du traitement par procoagulant 26,38,39.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’organisme de bien-être animal de Novo Nordisk A/S et l’Inspection danoise de l’expérimentation animale, ministère danois de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche. La méthode optimisée de 40 minutes inclut l’anesthésie et le temps de dosage dans la conception (Figure 1). Des souris hémophiles des deux sexes âgées de 10 à 16 semaines sont nécessaires pour cette procédure. <p cl…

Representative Results

Pour évaluer l’applicabilité du modèle optimisé, une étude a été réalisée chez des souris F8-KO (C57BL genetic background) administrées avec une thérapie de remplacement du facteur VIII recombinant disponible dans le commerce (rFVIII); quatre doses différentes ont été testées : 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg et 20 UI/kg. De plus, nous avons testé le témoin correspondant du véhicule (négatif) chez des souris F8-KO et un groupe de type sauvage (WT) en utilisant des souris C57BL comme groupe témoin positif…

Discussion

Cette méthode optimisée de transsection de la veine caudale (TVT) présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de survie TVT. Les animaux sont entièrement anesthésiés pendant toute la durée de l’étude, ce qui facilite la manipulation des souris et augmente le bien-être des animaux. De plus, contrairement au modèle de survie TVT, l’observation de nuit n’est pas nécessaire, et ce modèle optimisé offre la possibilité de mesurer la perte de sang et d’observer le temps de saignement exact sur …

Materials

#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo