꼬리 정맥 transection 출혈 모델 완전 마취 혈우병 A 마우스에서
Summary
마취된 마우스에서의 정제된 꼬리 정맥 횡단절(TVT) 출혈 모델은 혈우병성 출혈의 평가를 위한 민감한 생체내 방법이다. 이 최적화 된 TVT 출혈 모델은 혈액 손실과 출혈 시간을 종점으로 사용하여 다른 모델을 정제하고 사망을 종점으로 피합니다.
Abstract
꼬리 출혈 모델은 혈우병 연구에서 중요한 도구이며, 특히 procoagulant 효과의 평가를위한 것입니다. 꼬리 정맥 transection (TVT) 생존 모델은 FVIII의 임상 관련 용량에 대한 민감성으로 인해 많은 설정에서 선호되는 반면, 꼬리 클립 모델과 같은 다른 확립 된 모델은 더 높은 수준의 프로응고제 화합물을 필요로합니다. 생존을 종점으로 사용하지 않기 위해, 우리는 전체 실험 동안 혈액 손실과 출혈 시간을 종점 및 완전 마취로 확립하는 TVT 모델을 개발했습니다. 간단히 말해서, 마취 된 마우스는 꼬리가 온대 식염수 (37 ° C)에 잠겨있는 채로 위치되고 오른쪽 측면 꼬리 정맥에 시험 화합물과 함께 투여됩니다. 5 분 후, 왼쪽 측면 꼬리 정맥은 템플릿 가이드를 사용하여 횡단되고, 꼬리는 식염수로 되돌아 가며, 혈액을 수집하는 동안 모든 출혈 에피소드를 모니터링하고 40 분 동안 기록합니다. 부상 후 10 분, 20 분 또는 30 분에 출혈이 발생하지 않으면 젖은 거즈 면봉으로 절단을 두 번 닦아 혈전을 부드럽게 도전합니다. 40분 후, 혈액 손실은 식염수로 피흘린 헤모글로빈의 양에 의해 정량화된다. 이 빠르고 비교적 간단한 절차는 일관되고 재현 가능한 출혈을 초래합니다. TVT 생존 모델과 비교할 때, 약리학 적 개입에 대한 민감성을 손상시키지 않고보다 인간적인 절차를 사용합니다. 또한 두 성별을 모두 사용하여 3R의 원칙을 준수하여 사육해야하는 동물의 총 수를 줄일 수 있습니다. 출혈 모델의 잠재적 한계는 지혈의 확률적 특성이며, 이는 모델의 재현성을 감소시킬 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 수동 혈전 파괴는 모니터링 중에 혈전이 도전 받도록 보장하여 원발성 (혈소판) 지혈이 출혈을 멈추게합니다. 출혈 손상 모델의 카탈로그에 추가된이 추가는 표준화되고 인도적인 방식으로 procoagulant 효과를 특성화하는 옵션을 제공합니다.
Introduction
동물 모델은 혈우병의 발병 기전을 이해하고 치료 요법 및 치료법을 개발하고 테스트하는 데 필수적입니다. 인자 VIII 녹아웃 마우스 (F8-KO)는 혈우병 A 1,2의 연구에 널리 사용되는 모델이다. 이들 마우스는 질병의 주요 특징을 재분석 하고, 재조합 FVIII 제품 3,4,5 및 유전자 치료 전략 6,7과 같은 치료법의 개발에 널리 사용되어 왔다.
생체내에서 상이한 지혈성 화합물의 약리학적 효과를 평가하기 위한 다양한 출혈 손상 모델이 있다. 이러한 응고 모델 중 하나는 마우스 8,9,10,11,12,13,14에서 꼬리 정맥 횡단 생존 모델이며, 꼬리 횡단 후 삼출에서 생존하는 혈우병 마우스의 능력을 측정합니다. 이 방법은 40 년 전에도입 된 15 세 이상이며 여전히 9,16,17 명이 사용됩니다. 그러나이 모델은 생존을 종점으로 활용하고 최대 24 시간 동안 동물을 관찰해야하며, 그 동안 동물은 의식이 있으므로 통증과 고통을 경험할 수 있습니다.
꼬리 클립 모델 (꼬리 끝이라고도 함)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28과 같은 더 짧은 지속 시간 및 완전 마취하의 출혈 모델은 이전에 기술되었습니다. . 그럼에도 불구하고, 출혈 챌린지 후 혈액 손실의 완전한 정상화를 위해, 이들 모델은 임상적으로 투여된 것보다 훨씬 더 높은 전구응고 화합물 (예를 들어, FVIII)의 투여량을 필요로 한다29. 마취 하의 다른 손상 모델인 베나 사페나 출혈 방법은 낮은 용량의 프로응고제 화합물30에 민감하지만 혈전이 자주 중단되어야 하기 때문에 높은 수준의 실험자 개입이 필요합니다(제시된 모델에서 3회와 반대).
새로운 프로응고제 화합물을 시험하기 위한 공통 프로토콜로의 표준화는 실험실(31,32,33) 간의 데이터 비교를 크게 촉진할 것이다. TVT 모델에서, 연구 종점 (혈액 손실7,26, 출혈 시간9,34 및 생존율35,36)에 대한 공통된 합의는 아직 없으며, 실험 길이는 연구13에 따라 다릅니다.
우리의 주요 목표는 높은 재현성, 주문형 연구 가능성, 예방 적 치료, 생존 모델과 동등한 약리학 적 개입에 대한 민감성, 그러나 죽음이나 죽음에 가까운 죽음을 종점으로 사용하지 않는 최적화 된 모델을 설명하고 특성화하는 것입니다. 고통과 고통을 줄이기 위해, 동물들은 출혈 중에 의식해서는 안되며,보다 윤리적 인 종점이 구현되어야합니다37.
꼬리 클립 모델은 일반적으로 꼬리의 끝을 절단하거나, 예를 들어, 1-5 mm 18,19,20,21,23,24의 절단 또는 더 심한 변형에서, 꼬리 직경 약 1-3 mm 8,22,25에서 횡단하는 두 가지 변형 중 하나로 수행됩니다. . 이것은 측면 및 등쪽 정맥과 복부 동맥이 일반적으로 절단되기 때문에 결합 된 동맥 출혈을 일으키며, 일반적으로 절단이 클수록 procoagulant 화합물에 대한 민감도가 낮아집니다. 또한, 꼬리 끝이 절단되기 때문에, 동정맥 손상은 반대 조직없이 노출됩니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 가장 흔한 혈우병 출혈과 다르다.
이름에서 알 수 있듯이,이 논문에 설명 된 것과 같은 꼬리 정맥 횡단 모델에서 정맥 만 손상되어 독점적으로 정맥 출혈이 발생합니다. 혈관이 완전히 절단되지 않았기 때문에, 손상은 절단 모델에서보다 작을 것으로 예상되며, 혈전이 부착 될 수있는 절단 주위의 조직은 유지됩니다. 또한, 동맥과 반대로 정맥에 낮은 혈압이 있습니다. 이러한 요인들은 절단 모델에 비해 증가된 민감성에 기여하여, 출혈의 정상화가 임상적으로 관련된 대체 요법의 투여량, 예를 들어, 혈우병 A의 rFVIII를 사용하여 달성될 수 있도록 하며, 이는 전구응고제 치료 26,38,39의 효과의 크기 및 내구성을 평가하는데 유용하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
꼬리 정맥 횡단 (TVT)의이 최적화 된 방법은 TVT 생존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 동물은 전체 연구 기간 동안 완전히 마취되어 마우스 취급이 쉬워지고 동물 복지가 향상됩니다. 또한, TVT 생존 모델과 달리 야간 관찰이 필요하지 않으며,이 최적화 된 모델은 혈액 손실을 측정하고 40 분 동안 정확한 출혈 시간을 관찰 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 의식이있는 동물에서 출혈의 더 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esther Bloem과 Thomas Nygaard는 혈장에서 FVIII의 측정에 대한 지원을 인정 받았습니다. Bo Alsted는 템플릿 드로잉 및 가공 및 절단 블록으로 인정 받고 있습니다.
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
Referências
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