Den raffinerte hale vene transeksjon (TVT) blødning modell i bedøvede mus er en sensitiv in vivo metode for vurdering av hemofil blødning. Denne optimaliserte TVT blødningsmodellen bruker blodtap og blødningstid som endepunkter, raffinerer andre modeller og unngår døden som endepunkt.
Haleblødningsmodeller er viktige verktøy i hemofili forskning, spesielt for vurdering av prokoagulant effekter. Hale vene transeksjon (TVT) overlevelsesmodell har blitt foretrukket i mange settinger på grunn av følsomhet for klinisk relevante doser av FVIII, mens andre etablerte modeller, som hale klipp modellen, krever høyere nivåer av prokoagulant forbindelser. For å unngå å bruke overlevelse som endepunkt, utviklet vi en TVT-modell som etablerte blodtap og blødningstid som endepunkter og full anestesi under hele eksperimentet. Kort sagt er bedøvede mus plassert med halen nedsenket i temperert saltvann (37 °C) og dosert med testforbindelsen i høyre sidehaleåre. Etter 5 min blir venstre lateral hale vene transektert ved hjelp av en malguide, halen returneres til saltvannsoppløsningen, og alle blødningsepisoder overvåkes og registreres i 40 minutter mens du samler blodet. Hvis ingen blødning oppstår på 10 min, 20 min eller 30 min etter skade, blir blodpropp utfordret forsiktig ved å tørke kuttet to ganger med en våt gasbindpinne. Etter 40 min kvantifiseres blodtapet av mengden hemoglobin blødde inn i saltvannsoppløsningen. Denne raske og relativt enkle prosedyren resulterer i konsistente og reproduserbare blødninger. Sammenlignet med TVT-overlevelsesmodellen bruker den en mer human prosedyre uten å gå på kompromiss med følsomheten for farmakologisk inngrep. Videre er det mulig å bruke begge kjønn, og redusere det totale antall dyr som må avles, i samsvar med prinsippene til 3R. En potensiell begrensning i blødningsmodeller er den stokastiske naturen til hemostase, noe som kan redusere reproduserbarheten til modellen. For å motvirke dette sikrer manuell blodproppforstyrrelser at blodpropp utfordres under overvåking, og forhindrer at primær (blodplate) hemostase stopper blødningen. Dette tillegget til katalogen over blødningsskademodeller gir et alternativ for å karakterisere prokoagulant effekter på en standardisert og human måte.
Dyremodeller er avgjørende for å forstå patogenesen av hemofili og utvikle og teste behandlingsregimer og terapier. Factor VIII knock-out mus (F8-KO) er en mye brukt modell for studiet av hemofili A 1,2. Disse musene rekapitulerer viktige egenskaper ved sykdommen og har blitt mye brukt til utvikling av behandlinger, for eksempel rekombinante FVIII-produkter 3,4,5 og genterapistrategier 6,7.
Det finnes ulike blødningsskademodeller for å evaluere de farmakologiske effektene av forskjellige hemostatiske forbindelser in vivo. En av disse koagulasjonsmodellene er hale vene transeksjon overlevelsesmodell hos mus 8,9,10,11,12,13,14, som måler evnen til hemofile mus til å overleve ekssanguinasjon etter haletranseksjon. Denne metoden ble introdusert for mer enn fire tiår siden15 og brukes fortsatt 9,16,17. Modellen utnytter imidlertid overlevelse som endepunkt og krever observasjon av dyrene over en periode på opptil 24 timer, hvor dyrene er bevisste og dermed kan oppleve smerte og nød.
Blødningsmodeller med kortere varighet og under full anestesi har blitt beskrevet tidligere, for eksempel haleklippmodellen (også kjent som halespissen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Likevel, for en fullstendig normalisering av blodtap etter blødningsutfordringen, krever disse modellene doser av prokoagulantforbindelser (f.eks. FVIII) langt høyere enn de som administreres klinisk29. En annen skademodell under anestesi, vena saphena blødningsmetoden, er følsom for lavere doser av prokoagulantforbindelser30, men krever et høyt nivå av eksperimenteringsintervensjon siden blodproppene må forstyrres ofte (i motsetning til 3 ganger i den presenterte modellen).
Standardisering mot en felles protokoll for å teste nye prokoagulantforbindelser vil i stor grad lette datasammenligning mellom laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller er det ennå ikke en felles enighet om studerte endepunkter (blodtap 7,26, blødningstid 9,34 og overlevelsesrate35,36), og eksperimentell lengde varierer mellom studie13.
Vårt primære mål er å beskrive og karakterisere en optimalisert modell med høy reproduserbarhet, muligheten til å studere on-demand samt en profylaktisk behandling, følsomhet for farmakologisk intervensjon tilsvarende overlevelsesmodellen, men likevel ikke bruke død eller nær-døden som endepunkter. For å redusere smerte og nød bør dyrene ikke være bevisste under blødning og et mer etisk endepunkt må implementeres37.
Haleklipsmodeller utføres vanligvis i en av to varianter, enten amputerer spissen av halen, for eksempel amputasjon på 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller, i en mer alvorlig variant, transektert med en halediameter rundt 1-3 mm 8,22,25 . Dette forårsaker en kombinert arteriovenøs blødning, da laterale og dorsale årer og ventral arterie vanligvis blir kuttet, og generelt, jo større amputasjonen er, jo lavere følsomhet for en prokoagulant forbindelse. Videre, siden halespissen er amputert, blir arteriovenøs skade utsatt uten motstående vev; Dermed er det i det minste i teorien ulikt de vanligste hemofile blødningene.
Som navnet antyder, er bare venen skadet i hale vene transeksjonsmodeller som beskrevet i dette papiret, og dermed resulterer i en utelukkende venøs blødning. Siden fartøyet ikke er helt avskåret, forventes skaden å være mindre enn i amputasjonsmodellene, og vevet rundt kuttet, som en blodpropp kan holde seg til, beholdes. I tillegg er det lavere blodtrykk i venen i motsetning til arterien. Disse faktorene bidrar til økt følsomhet i forhold til amputasjonsmodeller, slik at normalisering av blødning kan oppnås med klinisk relevante doser av erstatningsterapi, for eksempel med rFVIII i hemofili A, som er nyttig for å evaluere omfanget og holdbarheten av effekter av prokoagulant behandling 26,38,39.
Denne optimaliserte metoden for hale vene transeksjon (TVT) har flere fordeler sammenlignet med TVT overlevelsesmetoden. Dyrene er fullt bedøvet for hele studievarigheten, noe som gjør musehåndtering enklere og øker dyrets velvære. Videre, i motsetning til TVT-overlevelsesmodellen, er det ikke nødvendig med observasjon over natten, og denne optimaliserte modellen gir muligheten til å måle blodtap og observere den nøyaktige blødningstiden over 40 minutter. Også lengre perioder med blødning hos bevisste dyr kan…
The authors have nothing to disclose.
Esther Bloem og Thomas Nygaard er anerkjent for støtte med målinger av FVIII i plasma. Bo Alsted er anerkjent for å tegne og bearbeide malen og kutte blokker.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |