Hale Vene Transeksjon Blødning Modell i Fullt Bedøvet Hemofili En Mus

Summary

Den raffinerte hale vene transeksjon (TVT) blødning modell i bedøvede mus er en sensitiv in vivo metode for vurdering av hemofil blødning. Denne optimaliserte TVT blødningsmodellen bruker blodtap og blødningstid som endepunkter, raffinerer andre modeller og unngår døden som endepunkt.

Abstract

Haleblødningsmodeller er viktige verktøy i hemofili forskning, spesielt for vurdering av prokoagulant effekter. Hale vene transeksjon (TVT) overlevelsesmodell har blitt foretrukket i mange settinger på grunn av følsomhet for klinisk relevante doser av FVIII, mens andre etablerte modeller, som hale klipp modellen, krever høyere nivåer av prokoagulant forbindelser. For å unngå å bruke overlevelse som endepunkt, utviklet vi en TVT-modell som etablerte blodtap og blødningstid som endepunkter og full anestesi under hele eksperimentet. Kort sagt er bedøvede mus plassert med halen nedsenket i temperert saltvann (37 °C) og dosert med testforbindelsen i høyre sidehaleåre. Etter 5 min blir venstre lateral hale vene transektert ved hjelp av en malguide, halen returneres til saltvannsoppløsningen, og alle blødningsepisoder overvåkes og registreres i 40 minutter mens du samler blodet. Hvis ingen blødning oppstår på 10 min, 20 min eller 30 min etter skade, blir blodpropp utfordret forsiktig ved å tørke kuttet to ganger med en våt gasbindpinne. Etter 40 min kvantifiseres blodtapet av mengden hemoglobin blødde inn i saltvannsoppløsningen. Denne raske og relativt enkle prosedyren resulterer i konsistente og reproduserbare blødninger. Sammenlignet med TVT-overlevelsesmodellen bruker den en mer human prosedyre uten å gå på kompromiss med følsomheten for farmakologisk inngrep. Videre er det mulig å bruke begge kjønn, og redusere det totale antall dyr som må avles, i samsvar med prinsippene til 3R. En potensiell begrensning i blødningsmodeller er den stokastiske naturen til hemostase, noe som kan redusere reproduserbarheten til modellen. For å motvirke dette sikrer manuell blodproppforstyrrelser at blodpropp utfordres under overvåking, og forhindrer at primær (blodplate) hemostase stopper blødningen. Dette tillegget til katalogen over blødningsskademodeller gir et alternativ for å karakterisere prokoagulant effekter på en standardisert og human måte.

Introduction

Dyremodeller er avgjørende for å forstå patogenesen av hemofili og utvikle og teste behandlingsregimer og terapier. Factor VIII knock-out mus (F8-KO) er en mye brukt modell for studiet av hemofili A ^1,2. Disse musene rekapitulerer viktige egenskaper ved sykdommen og har blitt mye brukt til utvikling av behandlinger, for eksempel rekombinante FVIII-produkter ^3,4,5 og genterapistrategier ^6,7.

Det finnes ulike blødningsskademodeller for å evaluere de farmakologiske effektene av forskjellige hemostatiske forbindelser in vivo. En av disse koagulasjonsmodellene er hale vene transeksjon overlevelsesmodell hos mus 8,9,10,11,12,13,14, som måler evnen til hemofile mus til å overleve ekssanguinasjon etter haletranseksjon. Denne metoden ble introdusert for mer enn fire tiår siden¹⁵ og brukes fortsatt ^9,16,17. Modellen utnytter imidlertid overlevelse som endepunkt og krever observasjon av dyrene over en periode på opptil 24 timer, hvor dyrene er bevisste og dermed kan oppleve smerte og nød.

Blødningsmodeller med kortere varighet og under full anestesi har blitt beskrevet tidligere, for eksempel haleklippmodellen (også kjent som halespissen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Likevel, for en fullstendig normalisering av blodtap etter blødningsutfordringen, krever disse modellene doser av prokoagulantforbindelser (f.eks. FVIII) langt høyere enn de som administreres klinisk²⁹. En annen skademodell under anestesi, vena saphena blødningsmetoden, er følsom for lavere doser av prokoagulantforbindelser³⁰, men krever et høyt nivå av eksperimenteringsintervensjon siden blodproppene må forstyrres ofte (i motsetning til 3 ganger i den presenterte modellen).

Standardisering mot en felles protokoll for å teste nye prokoagulantforbindelser vil i stor grad lette datasammenligning mellom laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller er det ennå ikke en felles enighet om studerte endepunkter (blodtap ^7,26, blødningstid ^9,34 og overlevelsesrate^35,36), og eksperimentell lengde varierer mellom studie¹³.

Vårt primære mål er å beskrive og karakterisere en optimalisert modell med høy reproduserbarhet, muligheten til å studere on-demand samt en profylaktisk behandling, følsomhet for farmakologisk intervensjon tilsvarende overlevelsesmodellen, men likevel ikke bruke død eller nær-døden som endepunkter. For å redusere smerte og nød bør dyrene ikke være bevisste under blødning og et mer etisk endepunkt må implementeres³⁷.

Haleklipsmodeller utføres vanligvis i en av to varianter, enten amputerer spissen av halen, for eksempel amputasjon på 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller, i en mer alvorlig variant, transektert med en halediameter rundt 1-3 mm ^8,22,25 . Dette forårsaker en kombinert arteriovenøs blødning, da laterale og dorsale årer og ventral arterie vanligvis blir kuttet, og generelt, jo større amputasjonen er, jo lavere følsomhet for en prokoagulant forbindelse. Videre, siden halespissen er amputert, blir arteriovenøs skade utsatt uten motstående vev; Dermed er det i det minste i teorien ulikt de vanligste hemofile blødningene.

Som navnet antyder, er bare venen skadet i hale vene transeksjonsmodeller som beskrevet i dette papiret, og dermed resulterer i en utelukkende venøs blødning. Siden fartøyet ikke er helt avskåret, forventes skaden å være mindre enn i amputasjonsmodellene, og vevet rundt kuttet, som en blodpropp kan holde seg til, beholdes. I tillegg er det lavere blodtrykk i venen i motsetning til arterien. Disse faktorene bidrar til økt følsomhet i forhold til amputasjonsmodeller, slik at normalisering av blødning kan oppnås med klinisk relevante doser av erstatningsterapi, for eksempel med rFVIII i hemofili A, som er nyttig for å evaluere omfanget og holdbarheten av effekter av prokoagulant behandling 26,38,39.

Protocol

Alle prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av Dyrevelferdsorganet i Novo Nordisk A/S, og det danske dyreforsøksinspektøratet, Det danske mat-, landbruks- og fiskeridepartementet. Den optimaliserte 40 minutters metoden inkluderer anestesi og doseringstid i designet (figur 1). Hemofile mus av begge kjønn mellom 10-16 uker er nødvendig for denne prosedyren. 1. Forberedelser før studien Forbered doseringsløsningene i de riktige ko…

Representative Results

For å vurdere anvendelsen av den optimaliserte modellen ble det utført en studie i F8-KO (C57BL genetisk bakgrunn) mus administrert med en kommersielt tilgjengelig rekombinant faktor VIII erstatningsterapi (rFVIII); fire forskjellige doser ble testet: 1 IE/kg, 5 IE/kg, 10 IE/kg og 20 IE/kg. Videre testet vi den tilsvarende kjøretøykontroll (negativ) i F8-KO mus og wild-type (WT) gruppe ved hjelp av C57BL mus som en positiv kontrollgruppe for å vurdere responsområdet i modellen. Etter den…

Discussion

Denne optimaliserte metoden for hale vene transeksjon (TVT) har flere fordeler sammenlignet med TVT overlevelsesmetoden. Dyrene er fullt bedøvet for hele studievarigheten, noe som gjør musehåndtering enklere og øker dyrets velvære. Videre, i motsetning til TVT-overlevelsesmodellen, er det ikke nødvendig med observasjon over natten, og denne optimaliserte modellen gir muligheten til å måle blodtap og observere den nøyaktige blødningstiden over 40 minutter. Også lengre perioder med blødning hos bevisste dyr kan…

Materials

#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo