Modelo de sangramento da transeção da veia da cauda em hemofilia totalmente anestesiada um camundongo

Summary

O modelo de sangramento de veia traseira refinada (TVT) em camundongos anestesiados é um método in vivo sensível para a avaliação do sangramento hemofílico. Este modelo de sangramento otimizado da TVT usa perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais, refinando outros modelos e evitando a morte como ponto final.

Abstract

Modelos de sangramento de cauda são ferramentas importantes na pesquisa de hemofilia, especificamente para a avaliação de efeitos procoagulantes. O modelo de sobrevivência da veia traseira (TVT) tem sido preferido em muitas configurações devido à sensibilidade a doses clinicamente relevantes de FVIII, enquanto outros modelos estabelecidos, como o modelo de clipe de cauda, requerem níveis mais elevados de compostos procoagulantes. Para evitar o uso da sobrevivência como ponto final, desenvolvemos um modelo de TVT estabelecendo perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais e anestesia completa durante todo o experimento. Brevemente, camundongos anestesiados são posicionados com a cauda submersa em soro fisiológico temperado (37°C) e dosados com o composto de teste na veia lateral direita da cauda. Após 5 minutos, a veia lateral esquerda é transectada usando um guia de modelo, a cauda é devolvida ao soro fisiológico, e todos os episódios de sangramento são monitorados e registrados por 40 minutos durante a coleta do sangue. Se não ocorrer sangramento em 10 min, 20 min ou 30 min após a lesão, o coágulo é desafiado suavemente limpando o corte duas vezes com um cotonete de gaze molhada. Após 40 min, a perda de sangue é quantificada pela quantidade de hemoglobina sangrada no soro fisiológico. Este procedimento rápido e relativamente simples resulta em sangramentos consistentes e reprodutíveis. Em comparação com o modelo de sobrevivência da TVT, utiliza um procedimento mais humano sem comprometer a sensibilidade à intervenção farmacológica. Além disso, é possível utilizar ambos os sexos, reduzindo o número total de animais que precisam ser criados, em adesão aos princípios das 3R’s. Uma limitação potencial nos modelos sanguíneos é a natureza estocástica da hemostase, que pode reduzir a reprodutibilidade do modelo. Para combater isso, a interrupção manual do coágulo garante que o coágulo seja desafiado durante o monitoramento, impedindo que a hemostasia primária (plaqueta) pare de sangrar. Esta adição ao catálogo de modelos de lesão hemorrágida fornece uma opção para caracterizar efeitos procoagulantes de forma padronizada e humana.

Introduction

Modelos animais são essenciais para compreender a patogênese da hemofilia e desenvolver e testar regimes e terapias de tratamento. O rato-nocaute Fator VIII (F8-KO) é um modelo amplamente utilizado para o estudo da hemofilia A ^1,2. Esses camundongos recapitulam características-chave da doença e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento de tratamentos, como produtos FVIII recombinantes ^3,4,5 e estratégias de terapia genética ^6,7.

Existem vários modelos de lesão hemorrágica para avaliar os efeitos farmacológicos de diferentes compostos hemostáticos in vivo. Um desses modelos de coagulação é o modelo de sobrevivência da transeção da veia traseira em camundongos 8,9,10,11,12,13,14, medindo a capacidade dos camundongos hemofílicos de sobreviver à exsanguinação após transeção de cauda. Este método foi introduzido há mais de quatro décadas^{, 15} e ainda é utilizado ^9,16,17. No entanto, o modelo utiliza a sobrevivência como ponto final e requer observação dos animais durante um período de até 24 horas, durante o qual os animais estão conscientes e, portanto, podem sentir dor e angústia.

Modelos de sangramento de menor duração e sob anestesia total foram descritos anteriormente, como o modelo de clipe de cauda (também conhecido como ponta traseira)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . No entanto, para uma normalização completa da perda de sangue após o desafio de sangramento, esses modelos requerem doses de compostos procoagulantes (por exemplo, FVIII) muito superiores aos administrados clinicamente²⁹. Um modelo diferente de lesão sob anestesia, o método de sangramento vena saphena, é sensível a doses mais baixas de compostos procoagulantes³⁰, mas requer um alto nível de intervenção experimentadora, uma vez que os coágulos devem ser interrompidos com frequência (ao contrário de 3 vezes no modelo apresentado).

A padronização para um protocolo comum para testar novos compostos procoagulantes facilitaria muito a comparação de dados entre os laboratórios 31,32,33. Nos modelos tvt, ainda não há uma concordância comum sobre os pontos finais estudados (perda de sangue ^7,26, tempo de sangramento ^9,34 e taxa de sobrevivência^35,36), e comprimento experimental varia entre os estudos¹³.

Nosso objetivo principal é descrever e caracterizar um modelo otimizado com alta reprodutibilidade, a possibilidade de estudar sob demanda, bem como um tratamento profilático, sensibilidade à intervenção farmacológica equivalente ao modelo de sobrevivência, mas não utilizando a morte ou quase-morte como pontos finais. Para reduzir a dor e a angústia, os animais não devem estar conscientes durante o sangramento e um ponto final mais ético precisa ser implementado³⁷.

Os modelos de clipe de cauda são geralmente conduzidos em uma das duas variantes, ou amputando a ponta da cauda, por exemplo, amputação de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 ou, em uma variante mais grave, transeccionada a um diâmetro de cauda em torno de 1-3 mm ^8,22,25 . Isso causa um sangramento arteriovenoso combinado, pois as veias laterais e dorsais e a artéria ventral são geralmente cortadas, e em geral, quanto maior a amputação, menor a sensibilidade a um composto procoagulante. Além disso, uma vez que a ponta da cauda é amputada, a lesão arteriovenosa é exposta sem qualquer tecido oposto; assim, pelo menos em teoria, é diferente dos sangramentos hemofílicos mais comuns.

Como o nome indica, apenas a veia é ferida em modelos de transeção da veia traseira, como descrito neste artigo, resultando em uma hemorragia exclusivamente venosa. Uma vez que o vaso não é totalmente cortado, espera-se que a lesão seja menor do que nos modelos de amputação, e o tecido ao redor do corte, que um coágulo pode aderir, é retido. Além disso, há pressão arterial mais baixa na veia em oposição à artéria. Esses fatores contribuem para um aumento da sensibilidade em relação aos modelos de amputação, de modo que a normalização do sangramento possa ser alcançada com doses clinicamente relevantes de terapia de reposição, por exemplo, com rFVIII em hemofilia A, o que é útil para avaliar a magnitude e durabilidade dos efeitos do tratamento procoagulante ^26,38,39.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Novo Nordisk A/S, e pela Inspetoria dinamarquesa de Experimentos Animais, Ministério dinamarquês de Alimentos, Agricultura e Pesca. O método otimizado de 40 minutos inclui anestesia e tempo de dosagem no desenho (Figura 1). Camundongos hemofílicos de ambos os sexos entre 10 e 16 semanas de idade são necessários para este procedimento. 1. Preparativos antes do est…

Representative Results

Para avaliar a aplicabilidade do modelo otimizado, foi realizado um estudo em camundongos F8-KO (C57BL de fundo genético) administrados com uma terapia de substituição recombinante de fator VIII comercialmente disponível (rFVIII); foram testadas quatro doses diferentes: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg. Além disso, testamos o controle correspondente do veículo (negativo) em camundongos F8-KO e grupo de tipo selvagem (WT) usando camundongos C57BL como um grupo de controle positivo para avaliar a faixa de respos…

Discussion

Este método otimizado de transeção de veias traseiras (TVT) tem várias vantagens em comparação com o método de sobrevivência da TVT. Os animais são totalmente anestesiados durante toda a duração do estudo, o que facilita o manuseio do rato e aumenta o bem-estar animal. Além disso, ao contrário do modelo de sobrevivência da TVT, a observação noturna não é necessária, e este modelo otimizado oferece a possibilidade de medir a perda de sangue e observar o tempo exato de sangramento acima de 40 minutos. Al…

Materials

#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo