Modelo de sangrado por transyección de la vena de la cola en ratones con hemofilia A totalmente anestesiada
Summary
El modelo de sangrado de transección refinada de la vena de la cola (TVT) en ratones anestesiados es un método sensible in vivo para la evaluación del sangrado hemofílico. Este modelo optimizado de sangrado TVT utiliza la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales, refinando otros modelos y evitando la muerte como punto final.
Abstract
Los modelos de sangrado de cola son herramientas importantes en la investigación de la hemofilia, específicamente para la evaluación de los efectos procoagulantes. El modelo de supervivencia de la transección de la vena de la cola (TVT) se ha preferido en muchos entornos debido a la sensibilidad a las dosis clínicamente relevantes de FVIII, mientras que otros modelos establecidos, como el modelo de clip de la cola, requieren niveles más altos de compuestos procoagulantes. Para evitar el uso de la supervivencia como punto final, desarrollamos un modelo de TVT que establece la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado como puntos finales y la anestesia completa durante todo el experimento. Brevemente, los ratones anestesiados se colocan con la cola sumergida en solución salina templada (37 ° C) y se dosifican con el compuesto de prueba en la vena lateral derecha de la cola. Después de 5 min, la vena de la cola lateral izquierda se transecta utilizando una guía de plantilla, la cola se devuelve a la solución salina y todos los episodios de sangrado se monitorean y registran durante 40 minutos mientras se recolecta la sangre. Si no se produce sangrado a los 10 minutos, 20 minutos o 30 minutos después de la lesión, el coágulo se desafía suavemente limpiando el corte dos veces con un hisopo de gasa húmeda. Después de 40 min, la pérdida de sangre se cuantifica por la cantidad de hemoglobina sangrada en la solución salina. Este procedimiento rápido y relativamente simple da como resultado hemorragias consistentes y reproducibles. En comparación con el modelo de supervivencia TVT, utiliza un procedimiento más humano sin comprometer la sensibilidad a la intervención farmacológica. Además, es posible utilizar ambos sexos, reduciendo el número total de animales que necesitan ser criados, en cumplimiento de los principios de las 3R. Una limitación potencial en los modelos de sangrado es la naturaleza estocástica de la hemostasia, que puede reducir la reproducibilidad del modelo. Para contrarrestar esto, la interrupción manual del coágulo asegura que el coágulo sea desafiado durante el monitoreo, evitando que la hemostasia primaria (plaquetaria) detenga el sangrado. Esta adición al catálogo de modelos de lesiones hemorrágicas proporciona una opción para caracterizar los efectos procoagulantes de una manera estandarizada y humana.
Introduction
Los modelos animales son esenciales para comprender la patogénesis de la hemofilia y desarrollar y probar regímenes de tratamiento y terapias. El ratón knock-out factor VIII (F8-KO) es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la hemofilia A 1,2. Estos ratones recapitulan características clave de la enfermedad y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de tratamientos, como los productos FVIII recombinantes 3,4,5 y las estrategias de terapia génica 6,7.
Existen varios modelos de lesiones hemorrágicas para evaluar los efectos farmacológicos de diferentes compuestos hemostáticos in vivo. Uno de estos modelos de coagulación es el modelo de supervivencia de la transección de la vena de la cola en ratones 8,9,10,11,12,13,14, que mide la capacidad de los ratones hemofílicos para sobrevivir a la exsanguinación después de la transección de la cola. Este método se introdujo hace más de cuatro décadas15 y todavía se utiliza 9,16,17. Sin embargo, el modelo utiliza la supervivencia como punto final y requiere la observación de los animales durante un período de hasta 24 h, durante el cual los animales están conscientes y, por lo tanto, pueden experimentar dolor y angustia.
Anteriormente se han descrito modelos sangrantes de menor duración y bajo anestesia completa, como el modelo de clip de cola (también conocido como punta de cola)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Sin embargo, para una normalización completa de la pérdida de sangre después del desafío hemorrágico, estos modelos requieren dosis de compuestos procoagulantes (por ejemplo, FVIII) mucho más altas que las administradas clínicamente29. Un modelo de lesión diferente bajo anestesia, el método de sangrado de vena saphena, es sensible a dosis más bajas de compuestos procoagulantes30, pero requiere un alto nivel de intervención del experimentador, ya que los coágulos deben interrumpirse con frecuencia (a diferencia de 3 veces en el modelo presentado).
La estandarización hacia un protocolo común para probar nuevos compuestos procoagulantes facilitaría en gran medida la comparación de datos entre laboratorios 31,32,33. En los modelos de TVT, aún no existe un acuerdo común sobre los criterios de valoración estudiados (pérdida de sangre 7,26, tiempo de sangrado 9,34 y tasade supervivencia 35,36), y la duración experimental varía entre los estudios13.
Nuestro objetivo principal es describir y caracterizar un modelo optimizado con alta reproducibilidad, la posibilidad de estudiar bajo demanda así como un tratamiento profiláctico, sensibilidad a la intervención farmacológica equivalente al modelo de supervivencia, pero sin utilizar la muerte o la casi muerte como criterios de valoración. Para reducir el dolor y la angustia, los animales no deben estar conscientes durante el sangrado y se debe implementar un punto final más ético37.
Los modelos de clip de cola generalmente se llevan a cabo en una de dos variantes, ya sea amputando la punta de la cola, por ejemplo, amputación de 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 o, en una variante más severa, transectada a un diámetro de cola alrededor de 1-3 mm 8,22,25 . Esto causa una hemorragia arteriovenosa combinada, ya que las venas lateral y dorsal y la arteria ventral generalmente se cortan, y en general, cuanto mayor es la amputación, menor es la sensibilidad a un compuesto procoagulante. Además, dado que la punta de la cola está amputada, la lesión arteriovenosa se expone sin ningún tejido opuesto; por lo tanto, al menos en teoría, es diferente a las hemorragias hemofílicas más comunes.
Como su nombre lo indica, solo la vena se lesiona en los modelos de transección de la vena de la cola como los descritos en este documento, lo que resulta en una hemorragia exclusivamente venosa. Dado que el vaso no está completamente cortado, se espera que la lesión sea más pequeña que en los modelos de amputación, y el tejido alrededor del corte, al que puede adherirse un coágulo, se retiene. Además, hay una presión arterial más baja en la vena en comparación con la arteria. Estos factores contribuyen a una mayor sensibilidad en relación con los modelos de amputación, de modo que la normalización de la hemorragia se puede lograr con dosis clínicamente relevantes de terapia de reemplazo, por ejemplo, con rFVIII en la hemofilia A, lo que es útil para evaluar la magnitud y durabilidad de los efectos del tratamiento procoagulante 26,38,39.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método optimizado de transección de la vena de la cola (TVT) tiene varias ventajas en comparación con el método de supervivencia de TVT. Los animales están completamente anestesiados durante toda la duración del estudio, lo que facilita el manejo del ratón y aumenta el bienestar animal. Además, a diferencia del modelo de supervivencia TVT, no se requiere observación nocturna, y este modelo optimizado ofrece la posibilidad de medir la pérdida de sangre y observar el tiempo exacto de sangrado durante 40 min….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esther Bloem y Thomas Nygaard son reconocidos por su apoyo con mediciones de FVIII en plasma. Bo Alsted es reconocido por dibujar y mecanizar la plantilla y cortar bloques.
Materials
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
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