Projetamos e construímos um laboratório móvel para medir as taxas respiratórias em mitocôndrias isoladas de animais silvestres capturados em locais de campo. Aqui, descrevemos o projeto e o equipamento de um laboratório mitocondrial móvel e os protocolos laboratoriais associados.
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Artigo de método
Desenvolvimento de um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial para medir a energia mitocondrial no campo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A energia mitocondrial é um tema central na bioquímica e fisiologia animal, com pesquisadores usando a respiração mitocondrial como uma métrica para investigar a capacidade metabólica. Para obter as medidas da respiração mitocondrial, amostras biológicas frescas devem ser usadas, e todo o procedimento laboratorial deve ser concluído dentro de aproximadamente 2 h. Além disso, vários equipamentos especializados são necessários para a realização desses ensaios laboratoriais. Isso cria um desafio para medir a respiração mitocondrial nos tecidos de animais selvagens que vivem longe dos laboratórios de fisiologia, já que os tecidos vivos não podem ser preservados por muito tempo após a coleta no campo. Além disso, o transporte de animais vivos a longas distâncias induz estresse, o que pode alterar a energia mitocondrial.
Este manuscrito apresenta o MitoMobile da Universidade de Auburn (AU), um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial que pode ser levado a campo e usado no local para medir o metabolismo mitocondrial em tecidos coletados de animais selvagens. São apresentadas as características básicas do laboratório móvel e os métodos passo a passo para medir as taxas de respiração mitocondrial isolada. Além disso, os dados apresentados validam o sucesso de equipar o laboratório móvel de fisiologia mitocondrial e fazer medidas da respiração mitocondrial. A novidade do laboratório móvel está na capacidade de ir a campo e realizar medições mitocondriais nos tecidos dos animais capturados no local.
Introdução
Até o momento, os estudos destinados a medir a energia mitocondrial têm sido limitados a animais de laboratório ou capturados perto de laboratórios de fisiologia estabelecidos, o que impediu os cientistas de realizar estudos bioenergéticos mitocondriais em tecidos coletados de animais durante atividades como migração, mergulho e hibernação 1,2,3,4,5,6 . Embora muitos pesquisadores tenham medido com sucesso as taxas metabólicas basais e de pico e o gasto energético
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Protocolo
As seções a seguir descrevem os métodos laboratoriais mitocondriais. Todos os procedimentos de manuseio e coleta de tecidos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Auburn (#2019-3582).
1. Descrição dos buffers utilizados para a coleta de dados
NOTA: Esses buffers podem ser preparados em um laboratório estacionário e movidos para o laboratório móvel antes da viagem de campo (a menos que indicado de outra forma abaixo).
- Preparar o tampão de isolamento mitocondrial do músculo esquelético com albumina de soro bovino (BSA), conforme demonstrado na Tab....
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Resultados
O presente manuscrito investigou a respiração mitocondrial de Mus musculus de origem selvagem (n = 7, macho = 5, fêmea = 2; idade = 1,30 ± 0,2 anos) em um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial (Figura 1). Para mensurar a respiração mitocondrial do músculo esquelético, todo o membro pélvico, portanto aeróbio e anaeróbio, foi utilizado para isolamento mitocondrial (Figura 2). Exemplos de dados brutos de respiração mitocondrial são mostrados na
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Discussão
O laboratório móvel de fisiologia mitocondrial permite aos pesquisadores isolar mitocôndrias e medir as taxas de respiração mitocondrial dentro de 2 h após a coleta de tecido em locais de campo remotos. Os resultados aqui apresentados sugerem que as medidas da respiração mitocondrial feitas no AU MitoMobile são comparáveis às medidas feitas em um laboratório de pesquisa da universidade. Especificamente, os valores do estado 3, estado 4 e RCR para Mus musculus de origem selvagem aqui apresentados são comparáveis .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Mark Nelms e John Tennant, do departamento de Engenharia Elétrica e de Computação da Faculdade de Engenharia Samuel Ginn da Universidade de Auburn, por ajudarem com o equipamento estrutural e elétrico do AU MitoMobile. Além disso, os autores reconhecem o financiamento para equipar o AU MitoMobile e a pesquisa de uma bolsa do Prêmio Presidencial da Universidade de Auburn para Pesquisa Interdisciplinar (PAIR).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga de 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tubos de centrífuga de 2,0 mL VWR | 87003-298 | ||
| Tubos de centrífuga de 50 mL | VWR | 21009-681 | Tubo de centrífuga Nalgene Oak Ridge |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Placa transparente de 96 poços | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogeneizador | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Papel | Incluído com Hansatech OxyGraph | ||
| Ácido graxo livre BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glicose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Seringas | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Seringas |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | Sem número de catálogo, mas pode ser encontrado em Produtos --> Unidades de Controle de Eletrodos | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malato | VWR | 97062-140 | |
| Manitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrana | incluída com Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policial | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | A tripsina é comumente usada; no entanto, outras proteases podem ser usadas. |
| Ácido pirúvico | VWR | 97061-448 | |
| Ditionito de sódio | VWR | AA33381-22 | |
| Succinato | VWR | 89230-086 | |
| Sacarose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
Referências
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K.
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Reimpressões e permissões
