本稿では、ミトタイマーバイオセンサーを搭載したアストロサイト培養物のミトコンドリアタイムラプスイメージング法と、ミトコンドリアダイナミクス、移動性、形態、生物形成、酸化還元状態、およびターンオーバーのマルチパラメトリック解析について説明する。
ミトコンドリアの神経レベルでの変化に多くの注意が払われているが、最近の証拠は、ミトコンドリアのダイナミクスとアストロサイトの機能が認知に関与していることを示している。本稿ではミトコンドリアバイオセンサーを搭載したアストロサイト培養物のタイムラプスイメージング法について説明する: MitoTimer.ミトタイマーはミトコンドリアダイナミクス、移動性、形態、生物形成、および酸化還元状態を評価するための強力でユニークなツールです。ここでは、培養、画像取得、およびそれ以降のミトコンドリア分析に関する異なる手順を提示する。
アストロサイトは、脳恒常性の維持において重要なプレーヤーです。彼らはおそらく脳内に重要な構造的役割を持つことは最もよく知られています, 血液脳関門の一部として 1 脳の脳の神経細胞とシナプスをサポートすることによって2.ニューロンのアストロサイト支持は、構造3と代謝4、5の両方であり、アストロサイトは神経新生およびシナプト生成を促進する一方で、乳酸のような主要な代謝産物を活性ニューロン4、6、7に提供する。構造支援の役割を超えて、アストロサイトはCa2+シグナル伝達および緩衝(自発的なミトコンドリアCa2+流入を含む)8、9、K+バッファリング10に参加する活性細胞であり、傷害時に脳のニーズに適応し、反応することができます11,12.このような動的細胞なので、アストロサイトは堅牢なエネルギー要件を持ち、効率的なミトコンドリアネットワークを必要とします。これらのミトコンドリアは、過剰な活性酸素種(ROS)13を緩衝する上で重要な役割を有する。エネルギー生成とROSバッファリングの個々またはローカルの役割に加えて、ミトコンドリアはネットワーク14として機能します。この意味で、それらは、ミトコンドリアの核分裂と融合との間の平衡を維持し、それぞれ15の新/減少したミトコンドリアおよび古い/酸化されたミトコンドリアを表す。細胞の全体的な酸化還元状態は、ミトコンドリアネットワークの酸化還元状態によって測定することができる。病理では、これは細胞が最適に機能していない可能性のある光を当てることができる重要な情報です。
近年、細胞内のミトコンドリアのダイナミクスと機能を研究するために多くのセンサーが開発されています。例えば、エネルギー交換(ATP)、酸化還元状態(NADH/NAD+、ROS)、および酵素機能(cAMP、Ca2+、Zn2+)を測定するセンサがミトコンドリア機能16の研究に現在使用されている。中でも、ミトコンドリア形態(大きさ、形状、表面積)、移動性(速度、変位)、ダイナミクス(融合・核分裂イベント)、およびミトコンドリアの回転率およびレドックス状態の変化に従うことを可能にする。MitoTimerは変異型赤蛍光タンパク質であるdrFP58317で、ヒトシトクロムcオキシダーゼ18のサブユニットVIIIからのミトコンドリアシグナルを有し、19は新たに合成されたミトコンドリアを緑色(488nm)および酸化ミトコンドリアを赤色(555nm)で可視化する。緑色(488nm)および赤色(555nm)蛍光比を用い、個々のミトコンドリアの同時評価、それらの形態解析、融合/核分裂事象、および酸化還元状態履歴20,21を可能にする。このユニークな特性は、ミトコンドリアの生理学的および病理学的役割に関する多くの科学的な質問を調査するために使用することができ、したがって、多くの異なる細胞タイプ内のミトコンドリアダイナミクスの根本的なメカニズムを明らかにするために非常に有望である。
我々は最近、ミトコンドリアの動的及び特にインビボおよびインビボ22のアストロサイトにおける機能を研究するために、新しいレンチウイルスベクター(LV-G1-MitoTimer-MiR124T、以下LV-G1-MitoTimerと呼ばれる)を開発した。LV-G1-MitoTimerは、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターgfaABC1Dの切り捨てられたバージョンを用いて、B3エンハンサー(gfaABC1D(B3)を用いて、以下G1と呼ばれる)先に説明したmiR124T神経細胞脱標的システム23と組み合わせる。それは、インビトロおよびインビボ22におけるアストロサイトにおけるミトコンドリアバイオセンサーの排他的な発現を可能にする。ここでは、ラット海馬アストロサイトの培養を行い、LV-G1-MitoTimerバイオセンサーを装備するためのさまざまなステップと、数回連続した時間/日の間にアストロサイトミトコンドリアの挙動に従うさまざまな顕微鏡ステップを示します。
ここでは、培養アストロサイトにおけるミトコンドリア系のダイナミクスおよび回転を縦方向に追従する新規の方法が提案されている。固定された細胞群または1つの個々の細胞(最も頻繁に文献で使用される)24、25のタイムラプスアプローチとは異なり、研究者は、同じ個々の細胞上で数日間の間にミトコンドリア系の進化に従うことができます。高レベルの光暴露が必要で、多くの個々の細胞の選択が実現不可能な単一ウェルライブイメージングとは対照的に、提案された方法は、ウェルの異なる領域のいくつかの異なる細胞を画像化し、それらを再画像化するために様々な時点でそれらの同じ細胞に戻ってくるこの顕微鏡の能力を利用する。対象の各細胞の各測定基準に対して行われるベースラインに対する正規化のおかげで、ミトコンドリア系の複雑さを考慮し、それぞれのベースライン画像に対する各細胞に対する処理の効果を調査します。顕微鏡は、このタイプのイメージングを一度に最大16個のウェルで自律的に行う能力(ウェルあたり5細胞をイメージング)することで、異なる日に様々な条件をイメージングすることに伴う実験的変動性なしに、ミトコンドリア系の異質性を分析中に適切に考慮することができます。
培養の質、LV-G1-MitoTimerバイオセンサーを発現するウイルス感染のレベル、顕微鏡と目的の種類、および適切な細胞の選択は、このプロトコルで可能な限り一貫性を保たなければならない重要な変数である。細胞密度、ベクターの種類、およびウイルス性の基線量体は、質問に応じて適合させることができる。これまでの研究では、LV-G1-MitoTimer式はミトコンドリア関数とダイナミクス21、22、26、27に有害な結果を持たないことが示されていますが、濃度が細胞に対して毒性がないことを確認することが不可欠です(例えば、コントロールの細胞の総数をチェックします)。単一の焦点面が使用されるように、アストロサイトは、(1)できるだけ平坦で、(2)他の標識細胞から分離し(皿中の変位の解析を簡素化する)、および(3)高い蛍光レベルを有する。培養中の細胞は形態において非常に可変であり得るため、ミトコンドリア系は非常に不均一であり得る。この文脈では、ROI(および細胞全体ではない)を分析することは、核内領域のようないくつかの問題のある領域を補償し、変動性を減少させる。比較的類似した細胞に対してベースラインを行い、できるだけ多くの細胞をサンプルすることが不可欠です。結果として、高い含有率の取得および分析顕微鏡が理想的に適しています。この縦方向のモニタリングの間、バイオセンサーの漂白を避けるために細胞を光に過度に露出しないことも重要です。
このイメージング方法は、その複雑さなしではならず、プロトコル全体で、顕微鏡での以前のテスト中に行われたトラブルシューティングを考慮に入れたいくつかのノートが含まれています。例えば、使用されるプレートコーティングの選択は、意図したアッセイに依存するが、アストロサイトの一次培養のための最も適した選択肢のための推奨事項が含まれていた。さらに、細胞間変動のために、1つの条件で少なくとも5細胞に対して画像取得を行う必要があります。具体的には、ベースラインイメージングで選択された細胞の中には死んでしまい、割り当てられた画像取得領域の枠から外れる細胞もあれば、形態を変える細胞もあるので、ミトコンドリアを分析で個別化することは非常に困難です。最初から多くの細胞をイメージングすると、実験の最後に分析するのに十分な大きさのサンプルサイズの細胞が発生する可能性が高くなります。このイメージング技術のより複雑な側面に加えて、このタイプのイメージングと分析の恩恵を受けることができる人に関しては、いくつかの完全な制限があります。画像取得の自動化を最大限に活用するためには、使用する顕微鏡は、画像間の時間間隔の速度(すなわち、このプロトコルでは3sごと)を処理できるオートフォーカスシステムを備え、各画像が撮影される前に問題のセルに一貫して焦点を合わせることができる必要があります。さらに、画像取得プロセス全体を自動化するJOBSソフトウェアがなければ、この方法は、適切な時点で再び各セルを手動で見つけてイメージングする必要があり、画像化されるセルの数によっては困難になり、不可能になる可能性があります。最後に、このイメージング法は、光漂白の問題に対して免疫がない。そのため、他の長期取得方法と同様に、光漂白の影響を受けにくい蛍光マーカーを選択し、可能な限りこの問題を回避するために画像取得を調整することが重要です。
この手法は、現在重要な方法で使用されている他の手法とは異なります。他のタイムラプス研究とは異なり、この技術は、ウェル全体の同じ位置でのイメージングを必要とせず、他の領域を画像化するためにプレートを手動で移動する必要もありません。これにより、研究者は1つの24時間の時間枠で多くの条件で多くの細胞を画像化する能力を可能にする。その結果、各ウェル内の多くの細胞に対してこのイメージングと分析を行う能力は、大きな細胞群を広く研究して得るのと同じ集団情報を提供し、さらに各細胞から特定の尺度を提供する。この方法に対する特定の点は、他の画像取得方法(上記で概説)には適用されない場合がありますが、この利点は、取得後に可能な分析の種類の複雑さを上回ります。この技術は、ミトコンドリア系、そしてその結果、培養されたアストロサイトに対する様々な治療法の正確な影響を研究者が見ることを可能にする。
さらに、この方法は、特定の文脈におけるミトコンドリアの行動と役割に関する多くの異なる科学的な質問に高度にカスタマイズ可能です。ここで概説されたプロトコルは、特に培養されたアストロサイトを扱う。しかし、他の多くの細胞タイプを使用することができ、テストできる治療は調査中の質問によってのみ制限されます。このタイプのイメージングは、ミトコンドリア挙動の集合的知識と理解、ミトコンドリア機能不全につながる根本的なメカニズム、および異なるタイプの細胞に存在する先天的なダイナミクスに対する多くの病理の影響を促進する可能性を秘めています。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、K.R.とローザンヌ大学病院(CHUV)に授与されたシナプシス財団のフェローシップによって支えられました。著者らはニコンの助け、特にJ.ガネヴァトに感謝している。
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |