हरपीज सिंप्लेक्स वायरस की Plaquing
Summary
प्लाक्विन एक नियमित विधि है जिसका उपयोग आबादी में जीवित वायरस को मापने के लिए किया जाता है। यद्यपि प्लाक्विन को अक्सर बैक्टीरिया और बैक्टीरियोफेज के साथ विभिन्न माइक्रोबायोलॉजी पाठ्यक्रमों में पढ़ाया जाता है, स्तनधारी वायरस की प्लाक्विन अधिक जटिल और समय लेने वाली है। यह प्रोटोकॉल उन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जो दाद सिंप्लेक्स वायरस के साथ नियमित रूप से काम करने के लिए मज़बूती से कार्य करते हैं।
Abstract
प्लाक्विन वायरस के लिए कई प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं, जिनमें कार्यप्रणाली के लिए प्राथमिक साहित्य के भीतर संदर्भ शामिल हैं। हालांकि, प्लाक्विन वायरस का प्रदर्शन करना मुश्किल हो सकता है, इसके विनिर्देशों और शोधन पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता होती है। यह नए छात्रों के लिए मास्टर करने के लिए एक अविश्वसनीय रूप से चुनौतीपूर्ण तरीका है, मुख्य रूप से क्योंकि इसके लिए सबसे मिनट के विवरण पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। plaquing दाद सिंप्लेक्स वायरस के इस प्रदर्शन को उन लोगों की मदद करनी चाहिए जिन्होंने वर्षों से विधि, विशेष रूप से इसकी बारीकियों की कल्पना के साथ संघर्ष किया है। जबकि यह पांडुलिपि मानक प्लाक्विन पद्धति के समान सिद्धांतों पर आधारित है, यह इस बात में भिन्न है कि इसमें (1) प्रक्रिया के दौरान व्यवधान से बचने के लिए मेजबान कोशिकाओं को संभालने के लिए सबसे अच्छा तरीका है, (2) virions के प्रसार को सीमित करने के लिए agarose की तुलना में अधिक उपयोगी चिपचिपा माध्यम, और (3) एक सरल निर्धारण और धुंधला प्रक्रिया जो मज़बूती से पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करती है। इसके अलावा, साथ का वीडियो प्रक्रिया में महीन भेदों को प्रदर्शित करने में मदद करता है, जो अक्सर पट्टिका assays के संचालन पर दूसरों को निर्देश देते समय याद किया जाता है।
Introduction
वायरस पट्टिका assays की शुरुआत 1890s1 में वायरस की पहली खोजों के लिए वापस जाना. तम्बाकू मोज़ेक वायरस को पहले अलग किया गया था और तंबाकू के पत्तों पर पारित किया गया था, जहां संक्रमण के व्यक्तिगत धब्बों को पहचाना जा सकता था और एक एकल, जीवित वायरस एंटिटी 2 से उत्पन्न होने के रूप में परिमाणित किया जा सकता था, जिसे बाद में एक virion2 के रूप में पहचाना गया था। बैक्टीरिया और बैक्टीरियोफेज के साथ बाद के मौलिक अध्ययनों ने इन वायरसों को पट्टिका करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों को पूरा किया, जिसमें विकास के मध्य-लॉग चरण में बैक्टीरिया, बैक्टीरियोफेज नमूनों का सीरियल कमजोर पड़ने, और बैक्टीरियल लॉन 3 में शाब्दिक छेद (नामित सजीले टुकड़े) के बाद के दृश्य के साथ शीर्ष आगर शामिल है।
पशु वायरस की प्लैंकिंग ने बैक्टीरियोफेज के साथ किए जा रहे रोमांचक शोध को पीछे छोड़ दिया, मुख्य रूप से क्योंकि संस्कृति में स्तनधारी कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए आवश्यक तरीकों को 1940 के दशक तक विकसित नहीं किया गया था। हालांकि, पूरे मेजबान जीव 4 की अनुपस्थिति में बढ़ती मुरीन कोशिकाओं के आगमन ने वायरस को संस्कृति और गिनने की क्षमता में एक नए युग को जन्म दिया। इस तरह के काम को चिकन कोशिकाओं में पश्चिमी इक्वाइन एन्सेफलोमाइलाइटिस वायरस और मानव कोशिकाओं में पोलियोवायरस के प्रसार और मात्रा के लिए विस्तारित किया गया था5,6। जैसा कि कृषि योग्य स्तनधारी कोशिकाओं के दायरे का विस्तार हुआ, विभिन्न वायरल संक्रमणों के लिए विभिन्न मेजबान कोशिकाओं के बेवी ने दुनिया को वायरस के सभी तरीकों का अध्ययन करने की संभावनाओं का एक कॉर्नुकोपिया दिया। इसमें मानव दाद वायरस, विशेष रूप से दाद सिंप्लेक्स वायरस -1 (एचएसवी -1) और -2 (एचएसवी -2) का प्रसार और परिमाणीकरण शामिल था, जो म्यूकोक्यूटेनियस घावों का कारण बनता है। महत्वपूर्ण रूप से, सभी पट्टिका assays लाइव virions के अस्तित्व पर निर्भर हैं, जो एक नमूना 9 में एक रिसेप्टर-मध्यस्थता फैशन में मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। पट्टिका assays5,10,11,12,13,14,15,16 के निष्पादन पर सर्वव्यापकता और प्रकाशनों की भीड़ के बावजूद, HSV-1/-2 के लिए ये तरीके कला और विज्ञान दोनों का मिश्रण हैं; एक प्रोटोकॉल में हर विस्तार के लिए उचित ध्यान के बिना परख का संचालन नहीं कर सकते हैं, और न ही एक प्रक्रिया में subtlety के लिए एक crticial आँख के बिना एक सफल परख निष्पादित कर सकते हैं. इस पांडुलिपि HSV-1 /-2 पट्टिका assays के लिए सबसे लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों में से एक को दर्शाता है, परख की कला है कि शायद ही कभी चर्चा कर रहे हैं की कला की ओर सटीक विवरण के साथ.
यह वर्तमान प्रोटोकॉल HSV-1 और -2 मज़बूती से के लिए लाइव पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (PFU) की गिनती प्राप्त करता है। सबसे अच्छे परिणाम वेरो कोशिकाओं (परिवर्तित अफ्रीकी हरे बंदर गुर्दे की उपकला कोशिकाओं) का उपयोग करके कम मार्ग (मार्ग संख्या 155 से नीचे) पर प्राप्त किए जाते हैं और नियमित रूप से अल्फा-एमईएम 17 में 10% भ्रूण बछड़े के सीरम (एफसीएस), एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन और एक एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक मिश्रण 18 के साथ पूरक होते हैं। वेरो कोशिकाओं को मानक रूप से इस माध्यम में प्रति सप्ताह दो से तीन बार 1/5 कमजोर पड़ने पर हर बार 1/5 कमजोर पड़ने पर प्रचारित किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि पट्टिका assays स्तनधारी सेल संस्कृति के रूप में ही लगभग के रूप में पुराने हैं, ऐसा लगता है कि प्रत्येक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल का अपना सेट है इस बुनियादी परख को निष्पादित करने के लिए5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी प्रयोगशालाओं (पीजेडी और बीजेएम) में अनगिनत छात्रों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इन तरीकों को परिष्कृत करने वाले वर्षों में हमारे साथ काम किया है। स्टेन व्यक्ति के लिए एक विशेष धन्यवाद, जिसके संरक्षण में इस पद्धति को पहली बार विकसित किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund और NIGMS Bridges द्वारा Baccalaureate अनुदान 5R25GM058264 के लिए समर्थित किया गया था। यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
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