Plaquing di herpes simplex virus
Summary
Plaquing è un metodo di routine utilizzato per quantificare i virus vivi in una popolazione. Sebbene il plaquing sia spesso insegnato in vari curricula di microbiologia con batteri e batteriofagi, il plaquing dei virus dei mammiferi è più complesso e richiede tempo. Questo protocollo descrive le procedure che funzionano in modo affidabile per il lavoro regolare con i virus dell’herpes simplex.
Abstract
Esistono numerosi protocolli pubblicati per plaquing dei virus, inclusi riferimenti all’interno della letteratura primaria per la metodologia. Tuttavia, l’applicazione di virus può essere difficile da eseguire, richiedendo attenzione alle sue specifiche e perfezionamento. È un metodo incredibilmente impegnativo da padroneggiare per i nuovi studenti, principalmente perché richiede un’attenzione meticolosa ai dettagli più minuti. Questa dimostrazione di plaquing herpes simplex virus dovrebbe aiutare coloro che hanno lottato con la visualizzazione del metodo, in particolare le sue sfumature, nel corso degli anni. Mentre questo manoscritto si basa sugli stessi principi della metodologia standard di plaquing, differisce in quanto contiene una descrizione dettagliata di (1) come gestire al meglio le cellule ospiti per evitare interruzioni durante il processo, (2) un mezzo viscoso più utile dell’agarosio per limitare la diffusione dei virioni e (3) una semplice procedura di fissazione e colorazione che produce risultati riproducibili in modo affidabile. Inoltre, il video di accompagnamento aiuta a dimostrare le distinzioni più sottili nel processo, che spesso mancano quando si istruiscono gli altri sulla conduzione di saggi di placca.
Introduction
Gli inizi dei test della placca virale risalgono alle prime scoperte di virus nel 18901. Il virus del mosaico del tabacco è stato isolato e trasmesso per la prima volta sulle foglie di tabacco, dove le singole macchie di infezione potevano essere riconosciute e quantificate come provenienti da una singola entità virale viva2, in seguito identificata come virione2. Successivi studi seminali con batteri e batteriofagi hanno perfezionato le tecniche utilizzate per placcare questi virus, compresi i batteri nella fase intermedia della crescita, la diluizione seriale di campioni di batteriofagi e l’agar superiore con successiva visualizzazione di fori letterali (denominati placche) nel prato batterico3.
Plaquing di virus animali ritardato l’eccitante ricerca condotta con batteriofagi, principalmente perché i metodi necessari per la crescita di cellule di mammifero in coltura non sono stati sviluppati fino al 1940s4. Tuttavia, l’avvento delle cellule murine in crescita in assenza dell’intero organismo ospite4 ha generato una nuova era nella capacità di coltivare e contare i virus. Tale lavoro è stato esteso per la propagazione e la quantificazione del virus dell’encefalomielite equina occidentale nelle cellule di pollo e del poliovirus nelle cellule umane5,6. Con l’espansione del regno delle cellule di mammifero coltivabili, lo stuolo di diverse cellule ospiti per varie infezioni virali ha dato al mondo una cornucopia di possibilità per studiare tutti i tipi di virus7. Ciò includeva la propagazione e la quantificazione degli herpesvirus umani, in particolare il virus dell’herpes simplex-1 (HSV-1) e -2 (HSV-2), che causano lesioni mucocutanee8. È importante sottolineare che tutti i saggi della placca dipendono dall’esistenza di virioni vivi, che possono entrare nelle cellule ospiti in modo mediato dal recettore in un campione9. Indipendentemente dall’ubiquità e dalla moltitudine di pubblicazioni sull’esecuzione di saggi di placca5,10,11,12,13,14,15,16, questi metodi per HSV-1/-2 sono una miscela di arte e scienza; non si può condurre il test senza un’adeguata attenzione ad ogni dettaglio del protocollo, né si può eseguire un test di successo senza un occhio crticiale per la sottigliezza nel processo. Questo manoscritto raffigura uno dei metodi più riproducibili per i saggi della placca HSV-1/-2, con dettagli precisi verso l’arte del saggio che sono raramente discussi.
Questo protocollo attuale ottiene conteggi di unità di formazione di placche vive (PFU) per HSV-1 e -2 in modo affidabile. I migliori risultati si ottengono utilizzando cellule Vero (cellule epiteliali del rene di scimmia verde africana trasformate) a basso passaggio (sotto il passaggio numero 155) e coltivate abitualmente in alfa-MEM17 integrate con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), L-alanil-L-glutammina e una miscela antibiotica / antimicotica18. Le cellule Vero vengono propagate in modo standard in questo mezzo due o tre volte alla settimana a una diluizione di 1/5 ogni volta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre i saggi della placca sono vecchi quasi quanto la coltura cellulare dei mammiferi, sembra che ogni laboratorio abbia il proprio set di protocolli per eseguire questo test di base5,6,10,11,12,13,14,15,16,20…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo innumerevoli studenti nei nostri laboratori (PJD e BJM) che hanno lavorato con noi nel corso degli anni perfezionando questi metodi. Un ringraziamento speciale a Stan Person, sotto la cui tutela questa metodologia è stata sviluppata per la prima volta. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal Fondo di supporto alla ricerca universitaria della Towson University Fisher College of Science and Math e dalla sovvenzione NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health’s National Institute of General Medical Sciences.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
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