Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu
Summary
Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia’yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.
Abstract
Mikroglia, beyinde yerleşik makrofajlar olarak, çevresel strese ve beyin homeostazına yanıt da dahil olmak üzere çeşitli işlevlerin temelidir. Mikroglia, geniş bir aktivasyon fenotipi spektrumunu benimseyebilir. Ayrıca, pro-inflamatuar fenotipi destekleyen mikroglia hem nörogelişimsel hem de nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilidir. İn vitro çalışmalar, spesifik hücre tiplerinde potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bağlamda, primer mikroglial kültürleri kullanarak in vitro mikroglial aktivasyon ve nöroinflamasyonu incelemek, mikroglial hücre hatlarından veya kök hücre kaynaklı mikroglialardan daha önemlidir. Bununla birlikte, bazı birincil kültürlerin kullanımı tekrarlanabilirlik eksikliğinden muzdarip olabilir. Bu protokol, mikroglia’yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntem önermektedir. Burada mRNA ekspresyon nicelemesi ve Cy3-boncuk fagositik testi ile 4 saat ve 24 saat sonra birkaç uyaran kullanılarak mikroglial aktivasyon gösterilmiştir. Mevcut çalışmanın, fizyolojik olarak ilgili mikroglia’yı juvenil gelişim aşamalarından izole etmek için kolayca tekrarlanabilir bir teknik sağlaması beklenmektedir.
Introduction
Mikroglia, erken embriyonik gelişim sırasında nöroepitelyuma göç eden yumurta sarısı kesesinin eritropoetik öncüllerinden türetilen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofaj benzeri hücrelerdir1. Bağışıklık fonksiyonlarının yanı sıra, nörogelişim sırasında, özellikle sinaptogenez, nöronal homeostaz ve miyelinasyon2 için önemli bir rol oynarlar. Yetişkinlikte, mikroglia çevreyi sürekli taramak için uzun hücresel süreçler geliştirir. Beyin hasarı veya beyin hastalığı gibi homeostaz rüptürleri durumunda, mikroglia morfolojik görünümlerini amip şeklini benimsemek, yaralı bölgeye göç etmek, birçok sitoprotektif veya sitotoksik faktörü artırmak ve serbest bırakmak için değiştirebilir. Mikroglia, gelişim evrelerine ve devam eden yaralanma tipine bağlı olarak heterojen aktivasyon durumlarına sahiptir 3,4,5. Bu çalışmada, bu aktivasyon durumları genel olarak üç farklı fenotipte sınıflandırılmıştır: pro-enflamatuar / fagositik, anti-enflamatuar ve immüno-düzenleyici, gerçekte durumundaha karmaşık olması muhtemel olduğunu akılda tutarak6.
Beyin gelişiminin erken aşamalarında in vivo mikroglial aktivasyonu ve nöroprotektif stratejilerin taranmasını incelemek, (1) sütten kesilmeden önce hayvanların kırılganlığı ve (2) mikroglial hücrelerin sayısının az olması nedeniyle zor olabilir. Bu nedenle, mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar toksisite 7,8,9, nöroprotektif stratejiler5,10,11,12,13,14 ve ko-kültürler 15,16,17,18,19,20,21 için yaygın olarak kullanılmaktadır. . In vitro çalışmalar mikroglial hücre hatlarını, kök hücre kaynaklı mikrogliayı veya birincil mikroglia kültürünü kullanabilir. Tüm bu yaklaşımların avantajları ve dezavantajları vardır ve seçim ilk biyolojik soruya bağlıdır. Birincil mikroglia kültürlerini kullanmanın faydaları, homojen genetik arka plan, patojensiz öykü ve hayvan ölümünden sonra mikroglianın uyarıldığı zamanın kontrolüdür22.
Yıllar geçtikçe, hem yenidoğan hem de yetişkin 23,24,25,26,27,28,29 kemirgenlerinden birincil mikroglia kültürlenmesi için farklı yöntemler (akış sitometrisi, sallama veya manyetik etiketleme) geliştirilmiştir. Bu çalışmada, fare yenidoğan yavrularından mikroglia izolasyonu, mikroboncuk kaplı anti-fare CD11b25,27,29 kullanılarak daha önce tarif edilen manyetik aktive hücre sıralama teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. CD11b, mikroglia da dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen bir integrin-reseptörüdür. Beyinde enflamatuar bir zorluk olmadığında, neredeyse tüm CD11b + hücreleri mikroglia30’dur. Daha önce yayınlanmış diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 23,24,25,26,27,28,29, mevcut protokol acil ex vivo mikroglial aktivasyon analizlerini ve yaygın in vitro primer mikroglial kültürü dengelemektedir. Bu nedenle, mikroglia (1) doğum sonrası günde (P) 8’de miyelin çıkarılması olmadan izole edilir, (2) serum olmadan kültürlenir ve (3) beyin izolasyonundan sadece 48 saat sonra siRNA, miRNA, farmakolojik bileşik ve / veya enflamatuar uyaranlara maruz kalır. Bu üç yönün her biri, mevcut protokolü alakalı ve hızlı hale getirir. Her şeyden önce, pediatrik mikroglia kullanımı, in vitro mikroglial reaktiviteyi potansiyel olarak değiştirebilecek ek bir demiyelinizasyon adımı gerektirmeden kültürde dinamik ve reaktif canlı hücrelerin elde edilmesini sağlar. Mevcut protokol, mikroglia’nın fizyolojik ortamına mümkün olduğunca yaklaşmayı amaçlamaktadır. Gerçekten de, mikroglia asla serum ile karşılaşmaz ve bu protokol de serum kullanımını gerektirmez. Dahası, mikroglia’yı kültürden sonra 48 saat kadar erken bir sürede açığa çıkarmak, fizyolojik fakültelerini kaybetmelerini önler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut çalışma, manyetik olarak sıralanmış CD11b + hücrelerini kullanarak birincil bir mikroglial hücre kültürü sunmaktadır. Mikroglial fonksiyonel değerlendirmeye (RT-qPCR ve fagositik tahliller) ek olarak, mikroglial kültür saflığı da belirlendi.
Klasik mikroglia hücre kültürleri genellikle P1 veya P2 kemirgen yenidoğan beyninden ve astrositlerle en az 10 gün boyunca ortak kültürden üretilir. Mikroglia daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcı kullanılarak mekanik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figürler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırma, Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco ve Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
Referências
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
