이 프로토콜은 해수 샘플에서 유해한 조류 꽃과 관련 미생물군유전체를 모니터링하기 위해 16S rRNA 및 18S rRNA 유전자를 대상으로 메타바코딩 분석 단계를 소개합니다. 그것은 강력한 분자 기반 도구이지만 시각적으로 단계별로 여기에 설명되는 몇 가지 절차가 필요합니다.
유해한 조류 꽃 (HABs) 모니터링은 전 세계적으로 구현되었으며, 수산과 양식으로 유명한 칠레는 이러한 목적을 위해 수십 년 동안 현미경 및 독소 분석을 집중적으로 사용했습니다. 고처리량 DNA 염기서열 분석 및 세균 조립 기반 접근법과 같은 분자 생물학적 방법은 칠레 HAB 모니터링에서 도입되기 시작했으며 절차는 아직 표준화되지 않았습니다. 여기서, 칠레 HABs를 모니터링하기 위한 16S rRNA 및 18S rRNA 메타바코딩 분석은 단계적으로 도입된다. 최근 가설에 따르면, 조류 세균 상호 연관은 꽃 개시, 유지 보수 및 회귀를 차지하는 중요한 시너지 또는 적대적 관계를 재생합니다. 따라서, 조류 세균성 관점에서 HAB를 모니터링하는 것은 HAB 메커니즘과 조기 경고의 기초를 더 폭넓게 이해할 수 있다. 메타바코딩 분석은 샘플에서 거대한 조류 세균 분류증 정보를 감지할 수 있기 때문에 이 목적을 위해 가장 적합한 분자 기반 도구 중 하나입니다. 본 원에서 메타바코딩 분석에 대한 샘플링의 시각적 절차는 신뢰할 수 있는 데이터의 오류 및 수집을 줄이는 것을 목표로 하는 구체적인 지침을 제공합니다.
많은 해양 식물성 식물성 플랑크톤 종은 내인성 독소를 생산하는 것으로 알려져 있으며,이 종은 충분한 수로 축적되면 해양 환경에 해롭습니다. 이러한 유해한 조류 꽃 (HABs)는 세계1의대부분의 대륙의 해안에서 오늘 관찰된다. 독성 식물성 플랑크톤은 먼저 쌍발판 조직에 축적되어 소화 시 인간을 포함한 더 높은 열대 지방 체 수준에서 질병과 사망으로 이어집니다. 그 후, 이러한 사건은 지역 경제, 사회 경제학 및 공중 보건2에심각한 영향을 미칩니다. HAB로 인한 세계 경제의 피해는매년수백만~수십억 달러로 추산됩니다 3. 칠레는 빈번한 HABs로 고통받는 많은 국가 중 하나입니다.
칠레는 북쪽과 남쪽으로 4,300km가 넘는 긴 땅의 나라입니다. 길쭉한 서부 땅은 태평양을 마주하고 있으며, 이는 칠레가 HAB를 경험할 확률을 자연스럽게 증가시킵니다. 특히 칠레 남부에는 세계적으로 유명한 연어 양식이 많으며, HAB가 이 지역에서 발생할 때마다 조류 독소는 거대한 양식 연어가 아프고4,5,6로죽는다. 칠레에서는 HAB가 경제를 가장 힘들게 강타한 해는 2016년으로, 연간 8억 달러의7,8달러의손실을 기록했습니다. 인과 성 독성 조류 종은 해마다 다양합니다. 2016 년 경우, 알렉산드리움 카타넬라와 슈도차토넬라 verruclosa의 단지는 남부 칠레 해안7의대부분에 광범위한 HAB를 발생7,8. 칠레에서 가장 최근의 HAB는 2021년 3월 칠레 남부카만차카에 위치한 이테로시그마 아카시우의 조류종과 함께 이 지역에 큰 연어 농장이 있는 곳에서 일어났습니다.
칠레는 두 가지 주요 방법을 사용하여 수년 동안 해안 모니터링을 수행해 왔습니다. 현미경으로 바닷물을 관찰하여 독성 조류 종을 정기적으로 식별하고 생화학적 분석을 통해 조개에서 독소 수준을측정합니다 9. 조개에서 독성 조류 및 독소 수준의 조기 검출은 HAB를 방지하지 않습니다; 그러나 이러한 분석은 즉각적인 대책을 촉발하고 지역 사회에 대한 피해를 줄일 수 있습니다. 이 전략의 효과를 더욱 강화하기 위해 최근 기존의 칠레 HAB 모니터링 프로그램에 분자 기반 분석 방법이 추가되어 해수 샘플에서 조류 및 관련 세균 지역 사회를 검출했습니다. 구체적으로, 16S rRNA 및 18S rRNA 유전자를 표적으로 하는 메타바코딩을 이용한 대규모 병렬 시퀀싱 방법이 선택되었다. 이 기술은 복잡한 절차와 비싼 기계 및 시약을 필요로하지만, 한 번에 해수 샘플에 존재하는 조류와 박테리아 제네라 / 종의 수천을 감지 할 수있는 고급 기술이다.
HAB의 원인은 온도와 계절 등 다양한 것으로 추측되지만 일반화하는 것은 불가능합니다. 이는 HAB 종및 주파수가 지역 및 현면 상태에 의존하기 때문에, 지리적 고유성, 영양 혼합 및 원소 유출과 같은 자연적인 현상을 수반하는 것은 2,10,11,12로인한 토지로부터의 원소 유출이다. 또한, 부영양화와 같은 인공적 인자는 지역 HABs12,13에영향을 미친다. 복잡한 다인자로 인해 정확한 HAB 예측을 하기가 쉽지 않습니다. 최근 몇 년 동안, 특정 세균 성 인구가 요인 중 하나로서 HABs의 발달과 관련이있을 수 있다는 견해가 있으며,이 가설을 지원하기 위한 연구는14,15,16,17,18로점점 더 분명해지고 있다. 분자 생물학 기술은 일반적으로 세균 성 조립을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 이러한 표준화된 방법은 칠레 HAB 모니터링9에아직 확립되지 않았다. HAB와 조류 세균 성 협회를 공부하기 위해, 동시에 현재 칠레 해안 모니터링 프로그램에 대한 메타 바코딩 분석을 수행하는 것이 필수적이다. 따라서, 이 프로토콜은 메타바코딩 분석을 사용하여 해수 샘플에서 조류 및 박테리아 종 검출을 분석하기 위한 단계별 절차에 초점을 맞춘 칠레 HAB 모니터링 프로그램을 시각적으로 소개합니다.
우리의 칠레 HAB 모니터링 프로그램을 설명하는 전체 프로토콜은 야리미즈 외9에서사용할 수 있습니다. 여기에는 해수 샘플링, 미세한 조류 종 검출, 조류 세균 유전자 검출, 안료 분석, 기상 데이터 수집 및 물리적 및 화학적 물 특성 분석 절차가 포함됩니다. 조류 및 세균성 종 검출을 위한 16S rRNA 및 18S rRNA 메타바코딩 분석의 단계별 프로토콜은프리프린트(19)로이용된다. 이 프로토콜은 HAB 모니터링 프로그램의 가장 복잡한 부분이자 하이라이트이기 때문에 특히 메타바코딩 분석 단계를 보여 줍니다. 이 프로토콜은 또한 조류 종의 프로그램 및 현미경 검출의 소개를 포함합니다. 대사코딩에 의해 조류 종을 분석할 때, 동시에 현미경 검사를 수행하여 두 가지 방법으로부터 결과를 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에는 분류 할당에 소프트웨어를 사용하는 방법은 포함되지 않지만 데이터베이스 권장 사항은 다음 섹션의 끝에 간략하게 명시되어 있습니다.
이 프로토콜은 칠레 HABs를 모니터링하기 위한 해수 샘플에서 조류 및 세균 종을 식별하기 위해 18S rRNA 및 16S rRNA 유전자 대사 코딩 분석을 성공적으로 수행했습니다. 이 프로토콜에 의해 검출된 지배적인 조류 및 몇몇 경미한 조류는 현미경 검사법에 의해 얻어진 것과 일치하여 프로토콜의 신뢰성을 확인했습니다. 프로토콜의 하이라이트는 분석 알렉산드리움 spp. 및 슈도차토넬라 spp.,남부 칠레에서 종을 일으키는 두 개의 가장 문제가 HAB, 심지어 낮은 풍부에 메트트리의 바닷물에서 검출. 특히, 슈도차트토넬라 spp. 세포가 가볍거나고정제(27,28)의사용 하에서 작고 쉽게 파열되기 때문에 현미경으로 식별하는 데 어려움을 겪고 있다. 메타바코딩은 현미경 검사가 식별할 수 없는 해수 샘플에 거의 존재하는 조류 종 정보를 제공할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 30 개 이상의 세균종을 검출했습니다. 이 박테리아가 조류 성장과 관련이 있는 방법은 이 시점에서 알려지지 않았지만, 타임시리즈 분석에서 조류 균 종의 대규모 데이터 수집은 아마도 그러한 중요한 발견을 제공 할 것입니다. 따라서 기존의 칠레 HAB 모니터링 프로그램에 메타바코딩 분석을 추가하면 의심할 여지 없이 현재HAB 모니터링 효율성을 강화할 수 있습니다. 사실, 메타바코딩 분석을 위한 이 시각적 프로토콜은 칠레물의 조류 세균 모니터링뿐만 아니라 전 세계 다른 HAB 영향 지역의 해안 모니터링 프로그램에도 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 위에서 언급한 이점을 제공했지만 메서드의 단점을 설명해야 합니다. 시각적 프로토콜에서 볼 수 있듯이 메타바코딩 방법은 시간이 많이 걸리고 복잡하므로 고가의 기계 및 시약이 필요합니다. 실험실 직원은 특별히 교육을 받아야하며 재료, 노동 및 시간을 낭비합니다. 또한, 대사코드에 의한 조류 검출은 두 개의 직교방법(29)으로부터동일한 지배적인 종들이 식별되는지 확인하기 위해 현미경 검사법과 결합되어야 한다. 현미경 검사는 조류 종을 식별하는 비 침습적 도구입니다, 조류 종은 독특하고 명백한 모양을 가질 때 실수를하기 어렵다는 것을 의미. 물론, 종들이 서로 매우 유사한 모양을 가지고 있다면 인간의 실수가 발생할 수 있습니다. 반면에 메타바코딩 해석에는 여러 단계가 필요하므로 자연스럽게 오류가 증가합니다. 샘플이 혼합되거나 잘못된 시약 추가 또는 일부 절차가 누락될 수 있습니다. 따라서, 현미경 검사법에 의해 얻어진 결과와 메타바코딩 결과를 비교하는 것이 중요합니다. 마지막으로 프로토콜은 질적으로만 적용되며 상대적 풍부를 위해 결과를 계산해야 합니다. 2019년에 언급한 바와 같이, 현재의 메타바코딩은 정량적 성능이 여전히 제한되어 있으며, 메타바코딩이 정량적응용(30)에자신있게 활용되기 전에 추가 연구가 필요하다.
이 프로토콜은 일루미나 Inc.가 발행한 16S 메타게노믹 시퀀싱 라이브러리 준비 매뉴얼에서 실행당 140-170 개의 샘플에 최적화되었습니다. 최적화된 프로토콜은 여러 번 테스트되었으며 이 최종 버전을 발급하도록 추가 수정되었습니다. 따라서 각 단계를 정확하게 따르는 것이 좋습니다. 프로토콜의 가장 중요한 부분은 샘플 오염을 피하기 위해 추가 주의가 필요하다는 것입니다. 파이펫과 라미나르 플로우 후드는 항상 70%의 알코올과 자외선 노출로 세척해야 하며, 멸균 가능한 물질은 자동 분해되어야 합니다. 프라이머와 시약은 새로운 모든 실행에서 주식에서 직접 희석되어야하며 시약과 여러 희석에 대한 노출을 재사용은 샘플 오염 원인이 될 수 있습니다. 프로토콜은 라미나르 흐름 후드 외부에서 작업을 수행할 수 있는 시기를 지정합니다. 그렇지 않으면 샘플을 세척된 라미나르 플로우 후드로 처리해야 합니다. 여러 개의 8튜브 스트립을 동시에 다룰 때, 다음 8튜브 스트립으로 이동하기 전에 첫 번째 8튜브 스트립에서 작업하고 캡을 씌는 것이 좋습니다. 뚜껑을 장시간 열어 두면 16S 및 18S rRNA 유전자가 주변에서 매우 유비쿼터스이기 때문에 샘플 오염을 일으킬 수 있습니다. 혼합 시간 및 인큐베이션 시간과 같은 명시된 시간은 여러 테스트 실행을 기반으로 각 단계에 대한 최상의 지속 시간을 선택했기 때문에 정확하게 설명된 대로 따라야 합니다. 예를 들어, 초과 또는 시간이 부족하면 샘플 수율을 줄일 수 있습니다. 이 프로세스는 프로토콜이 중지할 수 있다고 말하는 부분에서만 중지해야 합니다. 긍정적인 결과가 인위적인 거짓 긍정이 아니라는 것을 확인함에 따라 부정적인 제어를 갖는 것이 중요합니다. 마지막으로 모든 단계를 처리하는 데 최소 5일이 필요하고 다음 중단 기호가 있을 때까지 일부 부품을 중지할 수 없으므로 일을 계획하는 것이 좋습니다.
시퀀스 데이터에 대한 분류학적 할당의 제한은 여기에서 간략하게 지적됩니다. 세균성 및 조류 종에 대한 새로 발견 된 뉴클레오티드 서열은 매일 데이터 뱅크에서 업데이트됩니다. 잘 연구 된 조류와 세균성 종은 안정적으로 등록되어 있지만 데이터 뱅크에서 업데이트 된 알 수없는 종에 대한 많은 시퀀스도 있습니다. 등록된 뉴클레오티드 서열의 해상도가 종 식별을 위해항상 충분하지는 않지만 속 식별에만 충분하지 않다는 것을 나타냅니다. 따라서, 현미경 종 식별은 직교적으로 수행되어야 합니다. 이 작업에 대한 개방형 액세스 파이프라인을 설정하면 대규모 시퀀싱 된 데이터 집합을 한 번에 처리하고 오류가 발생할 때 효율적으로 조사하는 데 상당한 이점이 있습니다. 또한 DADA2의 출력은 텍스트 또는 csv 파일에 있으므로 추가 통계 분석이 용이합니다. 반면에 특히 데이터 집합이 큰 경우 분류 할당을 수행하기 위해 큰 서버가 필요합니다. 파이프라인을 설정하려면 파이프라인을 설정하려면 엔지니어가 필요하며 전문가는 매개 변수, 운영, Linux 및 생물 정보학을 이해해야 합니다.
HAB 모니터링 도구로서의 범위를 제외하고, 조사 연구를 위해 이 프로토콜의 사용을 확장할 수 있습니다. 예를 들어 칠레 정부와 지역 어부들 사이에는 지역 HAB31,32의증가에 관한 환경 평화 협회간의 논의가 계속되고 있습니다. 정부는 지구 온난화와 엘니뇨와 같은 자연 현상 때문이라고 주장하고 있으며, 이후 당사자들은 연어 양식이 원인이라고 주장합니다. 연어는 칠레의 토착 종이 아니며 반세기 전에 칠레 물에 있지 않았습니다. 당시 칠레 정부는 연어 사업33을개발하여 경제를 성장시키고 가난한 지역의 일자리를 창출하는 것을 목표로 삼았습니다. 자본이익을 위해 해외에서 개입한 칠레는 펜스타일의 양식업 개발에 큰 성공을 거두었으며, 연어의 수는 지난 수십 년 동안31,32,33로크게 증가했습니다. 그 후, 연어에 대한 많은 양의 음식이 바다에 던져져, 연어 양식이 자주 지역HABs31,32의이유라고 의심하는 지역 사람들을 선도하는. 진실은 지금 알려지지 않았지만, HAB로부터 지역 해양 환경, 경제 및 인간의 건강을 보호하기위한 전략이 고안 될 수 있도록 결국 이해되어야한다. 국소 조류 세균 관계에 대한 분자 기반 분석은 그러한 주제에 대한 단계 전진 해명에 기여할 수 있다. 예를 들어, 이 기술은 표적 해양 지역에 존재하지 않았지만 최근 몇 년 동안 극적으로 증가한 조류 및 세균종을 검색할 수 있으며, 이는 GIS 및 eDNA분석에의해 야마토 도롱뇽(Hynobiusvandenburghi)의기록되지 않은 집단의 발견을 위해 사카이 등의 연구와 다소 유사하다. 따라서 HAB 모니터링 도구를 넘어 이 메타바코딩 프로토콜은 다른 잠재 고객에게 잠재적인 사용이 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 칠레의 지속 가능한 개발 모니터링 조류 (SATREPS-MACH)를위한 과학 기술 연구 파트너십에 대한 연구를위한 보조금 (JPMJSA1705)에 의해 지원되었습니다. 샌드라 리오스 박사(유니버시다드 데 로스 라고스)에게 영화 클립을 사용할 수 있게 해 준 것에 감사드립니다. 우리는 원고의 그의 부지런한 교정에 대한 닐 앤드류 네덜란드 감사합니다. 우리는 식물플랑크톤 식별에 대한 조언을 위해 칠레 푸에르토 몽트의 CREAN-IFOP의 실험실 그룹 구성원에게 진심으로 감사를 표합니다.
1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
Heat block | |||
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |