Hel äggstocksimmunfluorescens, rensning och multifotonmikroskopi för kvantitativ 3D-analys av den utvecklande äggstocksreserven i mus

Summary

Här presenterar vi ett optimerat protokoll för avbildning av hela äggstockar för kvantitativa och kvalitativa analyser med hjälp av helmonterad immunfärgning, multifotonmikroskopi och 3D-visualisering och analys. Detta protokoll rymmer hög genomströmning, tillförlitlig och repeterbar bearbetning som är tillämplig för toxikologi, klinisk diagnostik och genomiska analyser av äggstocksfunktionen.

Abstract

Kvinnlig fertilitet och reproduktiv livslängd beror på kvaliteten och kvantiteten av äggstocksocytreserven. Uppskattningsvis 80% av kvinnliga könsceller som kommer in i meiotisk profas I elimineras under fetal oocyte attrition (FOA) och den första veckan av postnatal liv. Tre huvudmekanismer reglerar antalet oocyter som överlever under utvecklingen och etablerar äggstocksreserven hos kvinnor som går in i puberteten. I den första vågen av oocyteförlust elimineras 30-50% av oocyterna under tidig FOA, ett fenomen som tillskrivs högt långt isär kärnelement-1 (LINE-1) uttryck. Den andra vågen av oocyteförlust är eliminering av oocyter med meiotiska defekter genom en meiotisk kvalitetskontrollpunkt. Den tredje vågen av oocyteförlust uppträder perinatalt under primordial follikelbildning när vissa oocyter misslyckas med att bilda folliklar. Det är fortfarande oklart vad som reglerar var och en av dessa tre vågor av oocyteförlust och hur de formar äggstocksreserven hos antingen möss eller människor.

Immunofluorescens och 3D-visualisering har öppnat en ny väg för att avbilda och analysera oocyteutveckling i samband med hela äggstocken snarare än i mindre informativa 2D-sektioner. Denna artikel ger ett omfattande protokoll för hela äggstocksimmunfärgning och optisk rensning, vilket ger förberedelser för avbildning med hjälp av multifotonmikroskopi och 3D-modellering med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara. Den visar hur denna metod kan användas för att visa dynamiken i oocytens utmattning under äggstocksutveckling hos C57BL / 6J-möss och kvantifiera oocyteförlust under de tre vågorna av oocyteliminering. Detta protokoll kan tillämpas på prenatala och tidiga postnatala äggstockar för äggcellsvisualisering och kvantifiering, liksom andra kvantitativa metoder. Viktigt är att protokollet utvecklades strategiskt för att tillgodose hög genomströmning, pålitlig och repeterbar bearbetning som kan tillgodose behoven inom toxikologi, klinisk diagnostik och genomiska analyser av äggstocksfunktionen.

Introduction

De flesta däggdjurshonor föds med ett begränsat antal meiotiskt arresterade oocyter lagrade i primordiala folliklar, som utgör äggstocksreserven (OR)^1,2. OR bestämmer den totala kvinnliga reproduktiva livslängden och hälsan³. Operationssalen minskar normalt i storlek med åldrandet och kan utarmas i förtid vid exponering för vissa genotoxiska medel (strålning/kemoterapi) och miljöpåfrestningar (undernäring), vilket leder till infertilitet ^4,5,6. Idiopatisk kvinnlig infertilitet kan ofta hänföras till den genetiska och fysiologiska kvaliteten hos ägg som utvecklas från OR och förblir dåligt förstådd ^7,8. Eftersom kvinnlig follikelbegåvning till stor del är förutbestämd av födseln är det viktigt att förstå de regleringsmekanismer som är involverade i OR-etableringen och underhållet.

Hos möss börjar OR-bildning med specifikationen av primordiala könsceller (PGC) runt embryonal dag (E) 7,5². PGC: erna migrerar till könsorganen, där de kommer att bo med ungefär E10.5⁹. Följande omfattande proliferation sker med ofullständig cytokinesis vilket resulterar i bildandet av cystor som kommer att brytas ner senare i utvecklingen^10,11. Vid ungefär E12.5 bestäms gonadalt kön och PGC-proliferationen stannar i äggstockarna. Hos kvinnor kommer PGC, nu oocyter, in i meiotisk profas I (MPI) vid ungefär E13,5^12,13. Oocyter utvecklas genom utökad MPI och arrestering vid diktyatstadiet runt födelsetiden. Under den första veckan efter födseln omges varje arresterad äggcell av granulosaceller och bildar därigenom en primordial follikel.

Antalet primordiala folliklar i OR hos en kvinna beror på hur många oocyter som överlevde vågorna av oocyteliminering som inträffar före och under MPI-arrestering genom apoptos, autofagi eller nekros^14,15. Den första vågen sker under fosterutvecklingen och kallas FOA. FOA är en evolutionärt bevarad process hos honor (däggdjur och icke-däggdjur), varigenom uppskattningsvis 50-80% av oocyterna elimineras beroende på honarten 16,17,18,19. Hos möss förekommer FOA under E15,5 till E18,5 och har tillskrivits reaktivering och uttryck av retrotransposon LINE-1-sekvenser som orsakar oocytedöd^20,21. Den andra vågen av oocyteliminering sker genom en meiotisk kontrollpunkt som eliminerar oocyter med meiotiska defekter såsom oreparerade DNA-dubbelsträngsbrott (DSB)^22,23. Nästa våg av oocyteliminering sker under cystnedbrytning, som kulminerar under bildandet av primordiala folliklar, som var och en innehåller en enda oocyte 10,11,24,25.

Hos möss är den primordiala follikelreserven till stor del etablerad genom puberteten, varefter den minskar när primordiala folliklar aktiveras för tillväxt under regelbundna reproduktionscykler. OR-storleken varierar mellan enskilda kvinnor och mellan olika genetiska stammar av möss; ändå är den genetiska regleringen av OR-storlek inte väl förstådd 26,27,28,29. Genetiska studier av OR-reglering hindras av bristen på standardiserade protokoll för att studera vågorna av oocyteliminering under prenatal och postnatal utveckling. Flera oocytekvantifieringsmetoder har utvecklats hos möss, med den vanligaste och mest använda histomorfometriska utvärderingen av histologiska sektioner^30,31. I denna teknik identifieras oocyter på seriella sektioner med histologiska fläckar, såsom hematoxylin och eosin (H & E) och periodisk syra-Schiff (PAS) eller fluorescerande markörer. Denna teknik är tillförlitlig om alla förhållanden förblir konstanta, inklusive sektionstjocklek, effektiv återvinning av alla sektioner i hela äggstocken och räkningsscheman för enskilda laboratorier. Antalet som rapporteras av olika laboratorier skiljer sig dock ofta avsevärt och är därför inte lätt jämförbara.

Dessutom, med tanke på genetiska skillnader, kan användningen av olika musstammar också påverka oocytentalet. Ytterligare beräkningsmetoder har utvecklats för histomorfometrisk utvärdering och inkluderar automatiserad detektion av oocyter med hjälp av fraktioneringsmetoden, automatisk räkning med hjälp av beräkningsalgoritmer och 3D-rekonstruktion av histologiska bilder för att förhindra flera räkningar av samma oocyte 31,32,33,34,35,36 . Även med dessa förbättringar som läggs till histomorfometrisk utvärdering är tekniken relativt arbetsintensiv, särskilt för storskaliga studier med hög genomströmning. De insamlade uppgifterna kanske inte är reproducerbara och jämförbara mellan studier på grund av skillnader i räknescheman, datoralgoritmer och programvara som används.

Nyligen, accelererad av utvecklingen av nya medelupplösta multifoton- och ljusarkmikroskopi och optiska vävnadsrensningsmetoder, blir 3D-modellerings- och analystekniker för intakta äggstockar den valda metoden för att effektivt kvantifiera oocytetal och studera proteinlokalisering och dynamik^37,38. Dessa 3D-metoder är vanligtvis fördelaktiga jämfört med histologiska metoder eftersom vävnader och organ bättre bevaras och hålls intakta. Dessutom ger 3D-analys och modellering ytterligare insikter i funktion och interaktioner inom och mellan cellnischer eller understrukturer inom organet som kan missas i 2D-analys.

3D-analys av hela organ kräver optimering av fixering, immunfärgning och optiska clearingprotokoll för enskilda organ, såsom äggstockar, utan vävnadsförvrängning eller skada. Ytterligare optimering av provmontering för avbildning krävs för högupplöst mikroskopi och kan bero på vilken bildplattform som finns tillgänglig. Slutligen genererar avbildning av hela den intakta äggstocken en stor mängd data för efterföljande beräkningsanalyser. Därför finns det ett behov av att utveckla standardiserade 3D-metoder för att räkna oocyter för jämförande studier och över utvecklingsstadier.

Detta protokoll använder standard immunfärgning och tidigare rapporterade clearingprotokoll, med fokus på en enkel, användarvänlig och hög genomströmningsmetod 38,39,40,41. Protokollet är optimerat för att analysera ett stort antal prenatala och postnatala äggstockar fram till postnatal dag 28 (P28) och varierande storlekar av äggstockar från olika musgenetiska bakgrunder. Immunfärgningsstegen är likartade för alla steg; Clearingprotokollen skiljer sig emellertid åt för pubertala äggstockar på grund av deras större storlek, ScaleS4(0) och CUBIC för små respektive stora äggstockar,^{respektive 40,41}. Vidare utförs helkroppsperfusion i P28-möss före fixering för att förhindra autofluorescens från blodkroppar. Ett multifotonmikroskop byggdes på Leica DIVE/4Tune-plattformen som ett alternativ till ljusarkmikroskopi för att hämta bilder, och IMARIS 3D-visualiserings- och analysprogramvara med olika analysverktyg valdes för detta protokoll. Detta protokoll är enkelt att följa och mindre praktiskt, därmed tidsbesparande. Dessutom är oocytkvantifiering relativt snabb, beroende på storleken på äggstocken och arrangemanget av oocyter.

Protocol

Alla möss som användes var av den genetiska stammen C57BL/6J (se materialförteckningen). Denna stam har sekvenserats fullständigt och är standard för många studier om äggstocksstruktur och funktion. Möss inrymde enligt NIH-riktlinjerna, och procedurer som utfördes godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of The Jackson Laboratory. Reagenser och kompositioner som används i detta protokoll listas i materialförteckningen respektive tabell 1….

Representative Results

Immunfärgning och avbildning av hela äggstocken möjliggör visualisering och kvantifiering av oocyter eller proteinuttryck i äggstockar i olika utvecklingsstadier med samma teknik och markörer (Figur 3). Detta protokoll utvecklades för ett storskaligt projekt där analys av äggstockar i flera steg och från flera musstammar krävdes. Här presenterar vi data som samlats in för C57BL6 / J-stammen, en standardstam för genetisk analys. Tekniken som presenteras här är enkel, resultate…

Discussion

Denna artikel presenterar ett detaljerat 3D-immunfärgnings- och avbildningsprotokoll för prenatala och postnatala äggstockar för hög genomströmning och jämförande studier för bakteriecellskvantifiering och proteinlokalisering. Vi utvecklade detta protokoll för att analysera oocytetal i äggstockar (N = 6-12) vid sex utvecklingstidpunkter i 10-16 olika stammar, där 2-4 24-brunnsplattor vanligtvis bearbetas samtidigt. Denna metod kan anpassas för andra organ eller cellulära markörer. Till exempel kan detta pr…

Materials

Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp