Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l’imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un’elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Abstract

La fertilità femminile e la durata della vita riproduttiva dipendono dalla qualità e dalla quantità della riserva ovocitaria ovarica. Si stima che l’80% delle cellule germinali femminili che entrano nella profase meiotica I vengano eliminate durante l’attrito fetale degli ovociti (FOA) e la prima settimana di vita postnatale. Tre meccanismi principali regolano il numero di ovociti che sopravvivono durante lo sviluppo e stabiliscono la riserva ovarica nelle femmine che entrano nella pubertà. Nella prima ondata di perdita di ovociti, il 30-50% degli ovociti viene eliminato durante la FOA precoce, un fenomeno che viene attribuito all’elevata espressione dell’elemento nucleare-1 intervallato lungo (LINE-1). La seconda ondata di perdita di ovociti è l’eliminazione degli ovociti con difetti meiotici mediante un checkpoint di qualità meiotico. La terza ondata di perdita di ovociti si verifica perinatale durante la formazione del follicolo primordiale quando alcuni ovociti non riescono a formare follicoli. Non è chiaro cosa regoli ciascuna di queste tre ondate di perdita di ovociti e come modellano la riserva ovarica nei topi o negli esseri umani.

L’immunofluorescenza e la visualizzazione 3D hanno aperto una nuova strada per l’immagine e l’analisi dello sviluppo degli ovociti nel contesto dell’intera ovaia piuttosto che in sezioni 2D meno informative. Questo articolo fornisce un protocollo completo per l’immunocolorazione dell’ovaio intero e la compensazione ottica, producendo preparati per l’imaging utilizzando la microscopia multifotonica e la modellazione 3D utilizzando il software disponibile in commercio. Mostra come questo metodo può essere utilizzato per mostrare la dinamica dell’attrito degli ovociti durante lo sviluppo ovarico nei topi C57BL / 6J e quantificare la perdita di ovociti durante le tre ondate di eliminazione degli ovociti. Questo protocollo può essere applicato alle ovaie prenatali e postnatali precoci per la visualizzazione e la quantificazione degli ovociti, nonché altri approcci quantitativi. È importante sottolineare che il protocollo è stato sviluppato strategicamente per ospitare un’elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile in grado di soddisfare le esigenze in tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Introduction

La maggior parte delle femmine di mammifero nascono con un numero finito di ovociti meioticamente arrestati immagazzinati all’interno dei follicoli primordiali, costituendo la riserva ovarica (OR)^1,2. La sala operatoria determina la durata complessiva della vita riproduttiva femminile e la salute³. La sala operatoria normalmente diminuisce di dimensioni con l’invecchiamento e può essere prematuramente impoverita in caso di esposizione a determinati agenti genotossici (radiazioni / chemioterapia) e stress ambientali (malnutrizione), portando a infertilità ^4,5,6. L’infertilità femminile idiopatica può spesso essere attribuita alla qualità genetica e fisiologica delle uova che si sviluppano dalla sala operatoria e rimane poco compresa ^7,8. Poiché la dotazione del follicolo femminile è in gran parte predeterminata dalla nascita, è essenziale comprendere i meccanismi di regolazione coinvolti nella creazione e nel mantenimento della sala operatoria.

Nei topi, la formazione di OR inizia con la specifica delle cellule germinali primordiali (PGC) intorno al giorno embrionale (E) 7.5². I PGC migrano verso le creste genitali, dove risiederanno di circa E10,5⁹. La seguente proliferazione estesa si verifica con citochinesi incomplete con conseguente formazione di cisti che saranno scomposte più tardi nello sviluppo^10,11. A circa E12,5, viene determinato il sesso gonadico e la proliferazione della PGC si arresta nelle ovaie. Nelle femmine, le PGC, ora ovociti, entrano nella profase meiotica I (MPI) a circa E13.5 ^12,13. Gli ovociti progrediscono attraverso MPI estese e arresto nella fase dictyate intorno al momento della nascita. Durante la prima settimana dopo la nascita, ogni ovocita arrestato è circondato da cellule di granulosa, formando così un follicolo primordiale.

Il numero di follicoli primordiali nella sala operatoria di una femmina dipende da quanti ovociti sono sopravvissuti alle onde di eliminazione degli ovociti che si verificano prima e durante l’arresto delle MPI attraverso apoptosi, autofagia o necrosi^14,15. La prima ondata si verifica durante lo sviluppo fetale ed è nota come FOA. La FOA è un processo evolutivamente conservato nelle femmine (mammiferi e non mammiferi), per cui si stima che il 50-80% degli ovociti venga eliminato a seconda della specie femminile 16,17,18,19. Nei topi, foa si verifica durante E15.5 a E18.5 ed è stato attribuito alla riattivazione e all’espressione di sequenze line-1 di retrotrasposone che causano la morte degli ovociti^20,21. La seconda ondata di eliminazione degli ovociti avviene attraverso un checkpoint meiotico che elimina gli ovociti con difetti meiotici come le rotture a doppio filamento del DNA non riparato (DSB)^22,23. La successiva ondata di eliminazione degli ovociti si verifica durante la rottura della cisti, culminando durante la formazione dei follicoli primordiali, ognuno dei quali contiene un singolo ovocita ^10,11,24,25.

Nei topi, la riserva follicolare primordiale è in gran parte stabilita dalla pubertà, dopo di che diminuisce quando i follicoli primordiali vengono attivati per la crescita durante i cicli riproduttivi regolari. La dimensione della sala operatoria varia tra le singole donne e tra i diversi ceppi genetici di topi; tuttavia, la regolazione genetica delle dimensioni or non è ben compresa 26,27,28,29. Gli studi genetici sulla regolazione della sala operatoria sono ostacolati dalla mancanza di protocolli standardizzati per studiare le onde di eliminazione degli ovociti durante lo sviluppo prenatale e postnatale. Diverse metodologie di quantificazione degli ovociti sono state sviluppate nei topi, con la più comune e ampiamente utilizzata è la valutazione istomorfometrica delle sezioni^{istologiche 30,31}. In questa tecnica, gli ovociti vengono identificati su sezioni seriali con macchie istologiche, come ematossilina ed eosina (H & E) e marcatori periodici acido-Schiff (PAS) o fluorescenti. Questa tecnica è affidabile se tutte le condizioni rimangono costanti, compreso lo spessore della sezione, il recupero efficiente di tutte le sezioni in tutta l’ovaia e gli schemi di conteggio dei singoli laboratori. Tuttavia, i numeri riportati da diversi laboratori spesso differiscono in modo significativo e quindi non sono facilmente comparabili.

Inoltre, date le differenze genetiche, l’uso di diversi ceppi di topo può anche influenzare la conta degli ovociti. Ulteriori approcci computazionali sono stati sviluppati per la valutazione istomorfometrica e includono il rilevamento automatizzato degli ovociti utilizzando l’approccio del frazionatore, il conteggio automatico utilizzando algoritmi computazionali e la ricostruzione 3D di immagini istologiche per prevenire conteggi multipli dello stesso ovocita 31,32,33,34,35,36 . Anche con questi miglioramenti aggiunti alla valutazione istomorfometrica, la tecnica è relativamente laboriosa, in particolare per studi su larga scala e ad alto rendimento. I dati raccolti potrebbero non essere riproducibili e comparabili tra gli studi a causa delle differenze negli schemi di conteggio, negli algoritmi informatici e nel software utilizzato.

Recentemente, accelerata dallo sviluppo di nuovi metodi di microscopia multifotone e foglio luminoso a media risoluzione e metodi di compensazione ottica dei tessuti, le tecniche di modellazione e analisi 3D per le ovaie intatte stanno diventando il metodo di scelta per quantificare in modo efficiente il numero di ovociti e studiare la localizzazione e la dinamica delle proteine^37,38. Questi metodi 3D sono in genere vantaggiosi rispetto ai metodi istologici in quanto i tessuti e gli organi sono meglio conservati e mantenuti intatti. Inoltre, l’analisi e la modellazione 3D forniscono ulteriori informazioni sulla funzione e le interazioni all’interno e tra nicchie o sottostrutture cellulari all’interno dell’organo che possono mancare nell’analisi 2D.

L’analisi 3D di interi organi richiede l’ottimizzazione dei protocolli di fissazione, immunocolorazione e clearing ottico per singoli organi, come le ovaie, senza distorsioni o danni ai tessuti. Per la microscopia ad alta risoluzione è necessaria un’ulteriore ottimizzazione del montaggio del campione per l’imaging e può dipendere dalla piattaforma di imaging disponibile. Infine, l’imaging dell’intera ovaia intatta genera una grande quantità di dati per le successive analisi computazionali. Pertanto, è necessario sviluppare metodi 3D standardizzati per il conteggio degli ovociti per studi comparativi e attraverso le fasi dello sviluppo.

Questo protocollo utilizza protocolli di immunocolorazione standard e di compensazione precedentemente riportati, concentrandosi su un approccio semplice, intuitivo e ad alto rendimento 38,39,40,41. Il protocollo è ottimizzato per analizzare un gran numero di ovaie prenatali e postnatali fino al giorno 28 postnatale (P28) e varie dimensioni di ovaie provenienti da diversi background genetici di topo. Le fasi di immunocolorazione sono simili per tutte le fasi; tuttavia, i protocolli di compensazione differiscono per le ovaie puberali a causa delle loro dimensioni maggiori, ScaleS4(0) e CUBIC per ovaie piccole e grandi, rispettivamente^40,41. Inoltre, la perfusione di tutto il corpo viene eseguita nei topi P28 prima della fissazione per prevenire l’autofluorescenza dalle cellule del sangue. Un microscopio multifotone è stato costruito sulla piattaforma Leica DIVE/4Tune come alternativa alla microscopia a fogli luminosi per acquisire immagini, e per questo protocollo è stato scelto il software IMARIS 3D Visualization and Analysis con vari strumenti analitici. Questo protocollo è semplice da seguire e meno pratico, quindi consente di risparmiare tempo. Inoltre, la quantificazione degli ovociti è relativamente rapida, a seconda delle dimensioni dell’ovaio e della disposizione degli ovociti.

Protocol

Tutti i topi utilizzati erano del ceppo genetico C57BL/6J (vedi tabella dei materiali). Questo ceppo è stato completamente sequenziato ed è standard per molti studi sulla struttura e la funzione ovarica. I topi sono stati ospitati secondo le linee guida NIH e le procedure eseguite sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali del Jackson Laboratory. I reagenti e le composizioni utilizzati in questo protocollo sono elencati rispettivamente nella Tabella dei ma…

Representative Results

L’immunocolorazione e l’imaging dell’intera ovaia consentono la visualizzazione e la quantificazione dell’espressione di ovociti o proteine nelle ovaie in diversi stadi di sviluppo utilizzando la stessa tecnica e marcatori (Figura 3). Questo protocollo è stato sviluppato per un progetto su larga scala in cui era richiesta l’analisi delle ovaie in più fasi e da più ceppi di topo. Qui presentiamo i dati raccolti per il ceppo C57BL6/J, un ceppo standard per l’analisi genetica. La tecnica qui…

Discussion

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di immunocolorazione e imaging 3D per le ovaie prenatali e postnatali per studi comparativi ad alto rendimento per la quantificazione delle cellule germinali e la localizzazione delle proteine. Abbiamo sviluppato questo protocollo per analizzare il numero di ovociti nelle ovaie (N = 6-12) in sei punti temporali di sviluppo in 10-16 ceppi diversi, dove 2-4 piastre a 24 pozzetti vengono tipicamente elaborate contemporaneamente. Questo metodo può essere adattato per altri …

Materials

Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp