Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Resumo

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Resumo

Os fotorreceptores de rod são neurônios sensoriais altamente polarizados com compartimentos distintos. As hastes do mouse são longas (~80 μm) e finas (~2 μm) e são embaladas lateralmente na camada mais externa da retina, a camada fotorreceptora, resultando no alinhamento de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, a seção tangencial da retina congelada montada plana tem sido usada para estudar o movimento e a localização de proteínas dentro de diferentes compartimentos de vara. No entanto, a alta curvatura da retina do rato dominante da haste torna a seção tangencial desafiadora. Motivados pelo estudo do transporte de proteínas entre compartimentos, desenvolvemos dois métodos de descascamento que isolam de forma confiável o segmento externo da haste (ROS) e outros compartimentos subcelulares para manchas ocidentais. Nossas técnicas relativamente rápidas e simples fornecem frações enriquecidas e subcelulares específicas para medir quantitativamente a distribuição e redistribuição de importantes proteínas fotorreceptoras em hastes normais. Além disso, essas técnicas de isolamento também podem ser facilmente adaptadas para isolar e investigar quantitativamente a composição proteica de outras camadas celulares dentro da retina saudável e degenerada.

Introdução

As células fotorreceptoras de rod, bem embaladas na camada mais externa da retina neural, são parte integrante da visão de luz fraca. Para funcionar como contadores de fótons fiéis, as hastes utilizam uma via de sinalização baseada em proteína G, denominada fototransdução, para gerar respostas rápidas, amplificadas e reprodutíveis à captura de fótons únicos. Esta resposta à luz finalmente desencadeia uma mudança na correnteza na membrana plasmática e é posteriormente sinalizada para o resto do sistema ^visual1. Como o nome indica, cada célula de haste tem uma forma distinta semelhante a uma haste e exibe uma morfologia celular altamente polariza....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais locais do comitê de pesquisa em cuidados com animais da Universidade do Sul da Califórnia (USC).

1. Método de peeling de retina de células vivas

1. Preparação dos buffers de Ames, papéis descascando e prato de dissecção
   1. Utilizando uma tesoura de íris de ponta cega (ou tipo de tesoura equivalente), corte o papel filtro de celulose (Grau 413) em retângulos medindo aproximadamente 5 mm x 2,5 mm. Armazene as estacas para uso futuro.
   2. Prepare 1 L do buffer HEPES da Ames combinando uma garrafa de Ames'Medium, 2,38 g HEPES e ....

Resultados

As estratégias atuais foram desenvolvidas para fornecer métodos relativamente rápidos e simples para isolar e analisar proteínas entre compartimentos subcelulares específicos da haste para análise de manchas ocidentais. Aplicamos duas técnicas sequenciais de peeling (Figura 1 e Figura 2) seguidas de imunoblotting para demonstrar que esses métodos poderiam ser usados de forma confiável para detectar a distribuição conhecida de transdutina de haste (GNAT1) e arres.......

Discussão

Muitas doenças da retina afetam as células fotorreceptoras da haste, levando à morte da haste e, em última instância, à perda completa da ^visão37. Uma parte significativa das origens genéticas e mecanicistas da degeneração da retina humana foram recapituladas com sucesso em inúmeros modelos de camundongos ao longo dos anos. Nesse contexto, a capacidade de separar facilmente e seletivamente compartimentos subcelulares individuais da pequena retina do rato aumentaria muito nossa compreensão dos fund.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Garrafa de laboratório ou mídia de 100 mL equipada com um adaptador de tampa de tubulação	N/A	N/A
100% O2	tanque N/A	N/A
Superior de Garrafa de 1000mL, Material do Filtro PES, 0,22 μ m	Genesee Scientific	25-235
4X SDS Tampão de Amostra	Millipore Sigma	70607-3
50 mL Tubo Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
95% O2 e 5% CO2	tanque N/A	N/A
Ames' Meio com L-glutamina, sem bicarbonato	Sigma-Aldrich	A1420
CaCl2 (99%, di-hidratado)	Sigma	C-3881
Drierite (sulfato de cálcio anidro, >98% CaSO4, >2% CoCl2)	WA Hammond Drierite Co LTD	21005
Falcon Easy-Grip Petri Plate (poliestireno, 35 x 10 mm)	Falcon-Corning	08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)	Falcon-Corning	08-772F
Bisturi de penas (N.º 10, 40 mm)	VWR	100499-578
Bisturi de penas (N.º 11, 40 mm)	VWT	100499-580
KCl (99%)	Sigma	P-4504
Kimble Kontes pilão de pellets	Sigma	z359971
Balões de congelamento rápido Labconco	Labconco	N/A
LN2 (nitrogênio líquido) + balão Dewar ou balão de vácuo similar	N/A	N/A
MgCl2	Sigma	M-9272
Milli-Q/água desionizada	EMD Millipore	N/A
Na2HPO4 (pó)	J.T. Baker	4062-01
NaCl (cristal)	EMD Millipore	Sx0420-3
NaHCO3	Amresco	0865
OmniPur EDTA	EMD	4005
OmniPur HEPES, Ácido Livre	EMD	5320
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793
Reynolds Wrap Fita	Escocesa Reynolds Brands	N/A
Alumínio (12.7 mm x 32.9 m)	Scotch-3M	N/A
Desoxicolato de Sódio	Sigma-Aldrich	D67501
Spectrafuge	Labnet International, Inc	C1301
Câmara de incubação de tecido (comprada ou feita sob medida)	N/A	N/A
Tris-HCl	J.T.Baker	4103-02
Triton X-100	Signma-Aldrich	T8787
VirTis Liofilizador de Bancada 2K ou máquina equivalente	SP Scientific	N/A
VWR Grade 413 Papel para Arquivo (diâmetro 5,5 cm, tamanho do poro 5 μ m)	VWR	28310-015
Whatman Grau 1 Papel de Filtro Qualitativo (diâmetro 9 cm, tamanho do poro 11 μ m)	Whatman/GE Healthcare	1001-090
Pipeta de transferência de diâmetro largo, Global Scientific	VWR	76285-362

Filtro Mágica de Folha de Mini centrífuga