Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine
Summary
Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l’analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell’asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell’asta.
Abstract
I fotorecettori a bastoncello sono neuroni sensoriali altamente polarizzati con compartimenti distinti. Le aste di topo sono lunghe (~80 μm) e sottili (~2 μm) e sono impacchettate lateralmente nello strato più esterno della retina, lo strato di fotorecettore, con conseguente allineamento di compartimenti subcellulari analoghi. Tradizionalmente, il sezionamento tangenziale della retina piatta congelata è stato utilizzato per studiare il movimento e la localizzazione delle proteine all’interno di diversi compartimenti del bastoncello. Tuttavia, l’elevata curvatura della retina del topo dominante rende difficile il sezionamento tangenziale. Motivati dallo studio del trasporto proteico tra compartimenti, abbiamo sviluppato due metodi di peeling che isolano in modo affidabile il segmento esterno dell’asta (ROS) e altri compartimenti subcellulari per le macchie occidentali. Le nostre tecniche relativamente rapide e semplici forniscono frazioni arricchite e subcellulari specifiche per misurare quantitativamente la distribuzione e la ridistribuzione di importanti proteine fotorecettrici in barre normali. Inoltre, queste tecniche di isolamento possono anche essere facilmente adattate per isolare e studiare quantitativamente la composizione proteica di altri strati cellulari all’interno della retina sia sana che degenerata.
Introduction
Le cellule fotorecettrici a bastoncello, strettamente impacchettate nello strato più esterno della retina neurale, sono parte integrante della visione a luce fioca. Per funzionare come contatori di fotoni fedeli, le barre utilizzano una via di segnalazione basata sulla proteina G, chiamata fototrasduzione, per generare risposte rapide, amplificate e riproducibili alla cattura di singoli fotoni. Questa risposta alla luce alla fine innesca un cambiamento nella corrente sulla membrana plasmatica e viene successivamente segnalata al resto del sistema visivo1. Come suggerisce il nome, ogni cellula a bastoncello ha una forma distinta simile a un’asta e presenta una morfologia cellulare altamente polarizzata, costituita da un segmento esterno (OS), un segmento interno (IS), un corpo cellulare (CB) e un terminale sinaptico (ST). Ogni compartimento subcellulare ha specifici macchinari proteici (legati alla membrana e solubili), caratteristiche biomolecolari e complessi proteici che svolgono ruoli cruciali come la fototrasduzione visiva, la pulizia generale e la sintesi proteica e la trasmissione sinaptica2,3.
Oltre 30 anni fa, il movimento reciproco dipendente dalla luce delle proteine subcellulari, in particolare la trasducina (lontano dalla OS) e l’arrestina (verso la OS), è stato osservato per la prima volta4,5,6,7. All’inizio, questo fenomeno osservato è stato accolto con scetticismo, dovuto in parte alla vulnerabilità dell’immunoistochimica al mascheramento dell’epitopo8. Nei primi anni 2000, la traslocazione proteica dipendente dallo stimolo è stata confermata utilizzando una rigorosa e ardua tecnica di sezionamento fisico9. Il sezionamento tangenziale seriale della retina di roditore piatta congelata seguito da immunoblotting ha rivelato che la transtracina9,10, l’arrestina11,12 e la recuperina13 subiscono tutte una ridistribuzione subcellulare in risposta alla luce. Si ritiene che la traslocazione guidata dalla luce di queste proteine chiave di segnalazione non solo regoli la sensibilità della cascata di fototrasduzione9,14,15, ma possa anche essere neuroprotettiva contro i danni alla luce16,17,18. Poiché il trasporto di proteine guidato dalla luce nelle barre sembra essere molto significativo per la biologia e la fisiologia delle cellule dei bastoncelli, le tecniche che consentono l’isolamento di diversi compartimenti subcellulari per determinare la distribuzione delle proteine sono preziosi strumenti di ricerca.
Attualmente, ci sono alcuni metodi volti a isolare i compartimenti subcellulari dell’asta. Tuttavia, questi metodi possono essere lunghi e difficili da riprodurre, o richiedono una quantità considerevole di isolato retinico. I preparati del segmento esterno dell’asta (ROS) tramite centrifugazione a gradiente di densità19, ad esempio, sono comunemente usati per separare il ROS dall’omogeneizzato retinico. Questo metodo è ampiamente utilizzato per western blot, ma la procedura richiede molto tempo e richiede un minimo di 8-12 retina murina20. D’altra parte, il sezionamento tangenziale seriale della retina murina e di ratto congelata è stato implementato con successo nell’isolamento del sistema operativo, IS, CB e ST9,11,13. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente impegnativo a causa della necessità di appiattire completamente la retina murina piccola e altamente curva per allineare gli strati retinici prima della sezione tangenziale. Poiché ci sono una pletora di modelli murini e topi transgenici che ricapitolano le malattie del sistema visivo, la creazione di una tecnica che separa in modo affidabile, rapido e facile i singoli compartimenti delle aste è promettente nel rivelare i processi fisiologici che si verificano in ciascun compartimento specializzato e i meccanismi che sono alla base dei processi visivi in salute e malattia.
Per facilitare queste indagini, descriviamo due metodi di peeling che isolano i compartimenti subcellulari delle aste più facilmente rispetto ai protocolli attuali. Il primo metodo di peeling, adattato da una tecnica per esporre cellule bipolari marcate fluorescentemente per la registrazione del patch clamp21, impiega carta da filtro in cellulosa per rimuovere sequenzialmente il ROS da una retina murina isolata e viva (Figura 1). Il secondo metodo, adattato da una procedura che isola i tre strati primari di cellule retiniche da una retina chick22 e frog23, utilizza nastro adesivo per rimuovere il ROS e il segmento interno dell’asta (RIS) da una retina liofilizzata (Figura 2). Entrambe le procedure possono essere completate in 1 ora e sono notevolmente facili da usare. Forniamo la convalida dell’efficacia di questi due protocolli di separazione per western blot utilizzando retina adattata al buio ed esposta alla luce da topi C57BL / 6J per dimostrare la traslocazione indotta dalla luce di transducina rod (GNAT1) e arrestina (ARR1). Inoltre, utilizzando il metodo di peeling del nastro, forniamo ulteriori prove che la nostra tecnica può essere utilizzata per esaminare e affrontare le incongruenze tra i dati di localizzazione delle proteine acquisiti dall’immunocitochimica (ICC) e i western blots. Nello specifico, la nostra tecnica ha dimostrato che: 1) l’isoforma della proteina chinasi C-alfa (PKCα) è presente non solo nelle cellule bipolari, ma anche nei ROS murini e nei RIS, anche se in basse concentrazioni24,25, e 2) la rodopsina chinasi (GRK1) è presente prevalentemente nel campione isolato di OS. Questi dati dimostrano l’efficacia delle nostre due tecniche di peeling per separare e quantificare specifiche proteine del bastoncello e della retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molte malattie della retina colpiscono le cellule dei fotorecettori dei bastoncelli, portando alla morte dei bastoncelli e, in definitiva, alla completa perdita della vista37. Una parte significativa delle origini genetiche e meccanicistiche della degenerazione retinica umana è stata ricapitolata con successo in numerosi modelli murini nel corso degli anni. In tale contesto, la capacità di separare facilmente e selettivamente i singoli compartimenti subcellulari dei bastoncelli dalla retina del …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant EY12155, EY027193 e EY027387 a JC. Siamo grati al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) e Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) per la correzione del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) e il Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) per aver fornito l’attrezzatura necessaria per raccogliere i filmati forniti dall’autore. Materiale da: Kasey Rose et al, Separazione dei compartimenti cellulari dei fotorecettori nella retina del topo per l’analisi delle proteine, Neurodegenerazione molecolare, pubblicato [2017], [Springer Nature].
Materials
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
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