Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas
Summary
Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.
Abstract
Los fotorreceptores de varilla son neuronas sensoriales altamente polarizadas con compartimentos distintos. Los bastones de ratón son largos (~80 μm) y delgados (~2 μm) y están empaquetados lateralmente en la capa más externa de la retina, la capa fotorreceptora, lo que resulta en la alineación de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, la sección tangencial de la retina plana congelada se ha utilizado para estudiar el movimiento y la localización de las proteínas dentro de diferentes compartimentos de bastones. Sin embargo, la alta curvatura de la retina del ratón dominante en bastón hace que la sección tangencial sea un desafío. Motivados por el estudio del transporte de proteínas entre compartimentos, desarrollamos dos métodos de peeling que aíslan de manera confiable el segmento externo de varilla (ROS) y otros compartimentos subcelulares para western blots. Nuestras técnicas relativamente rápidas y simples entregan fracciones enriquecidas y subcelulares específicas para medir cuantitativamente la distribución y redistribución de importantes proteínas fotorreceptoras en bastones normales. Además, estas técnicas de aislamiento también se pueden adaptar fácilmente para aislar e investigar cuantitativamente la composición proteica de otras capas celulares dentro de retinas sanas y degeneradas.
Introduction
Las células fotorreceptoras de varilla, estrechamente empaquetadas en la capa más externa de la retina neural, son una parte integral de la visión con luz tenue. Para funcionar como contadores de fotones fieles, las varillas utilizan una vía de señalización basada en proteína G, denominada fototransducción, para generar respuestas rápidas, amplificadas y reproducibles a la captura de un solo fotón. Esta respuesta a la luz finalmente desencadena un cambio en la corriente en la membrana plasmática y posteriormente se señala al resto del sistema visual1. Como su nombre lo indica, cada célula de varilla tiene una forma distinta en forma de varilla y exhibe una morfología celular altamente polarizada, que consiste en un segmento externo (OS), segmento interno (IS), cuerpo celular (CB) y terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular tiene una maquinaria proteica específica (unida a la membrana y soluble), características biomoleculares y complejos de proteínas que desempeñan funciones cruciales como la fototransducción visual, la limpieza general y la síntesis de proteínas, y la transmisión sináptica2,3.
Hace más de 30 años, se observó por primera vez el movimiento recíproco dependiente de la luz de las proteínas subcelulares, específicamente la transducina (lejos del SO) y la arrestina (hacia la SG)4,5,6,7. Al principio, este fenómeno observado fue recibido con escepticismo, debido en parte a la vulnerabilidad de la inmunohistoquímica al enmascaramiento del epítopo8. A principios de la década de 2000, se confirmó la translocación de proteínas dependientes de estímulos mediante el uso de una rigurosa y ardua técnica de seccionamiento físico9. La seccionamiento tangencial serial de las retinas de roedores de montaje plano congelado seguido de inmunoblotting reveló que la transducina9,10, la arrestina11,12 y la recuperación13 experimentan redistribución subcelular en respuesta a la luz. Se cree que la translocación impulsada por la luz de estas proteínas clave de señalización no solo regula la sensibilidad de la cascada de fototransducción9,14,15, sino que también puede ser neuroprotectora contra el daño de la luz16,17,18. Debido a que el transporte de proteínas impulsado por la luz en bastones parece ser muy significativo para la biología y fisiología celular de los bastones, las técnicas que permiten el aislamiento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar la distribución de proteínas son herramientas de investigación valiosas.
Actualmente, hay algunos métodos destinados a aislar los compartimentos subcelulares de los bastones. Sin embargo, estos métodos pueden ser largos y difíciles de reproducir, o requieren una cantidad considerable de aislamiento de retina. Las preparaciones de segmentos externos de varilla (ROS) a través de la centrifugación por gradiente de densidad19, por ejemplo, se usan comúnmente para separar las ROS del homogeneizado retiniano. Este método es ampliamente utilizado para western blot, pero el procedimiento lleva mucho tiempo y requiere un mínimo de 8-12 retinas murinas20. Por otro lado, la seccionamiento tangencial serial de retinas murinas y de rata congeladas se ha implementado con éxito en el aislamiento de la SG, IS, CB y ST9,11,13. Sin embargo, este método es técnicamente desafiante debido a la necesidad de aplanar completamente la retina murina pequeña y altamente curvada para alinear las capas retinianas antes de la sección tangencial. Dado que hay una gran cantidad de modelos de ratones y ratones transgénicos que recapitulan enfermedades del sistema visual, la creación de una técnica que separe de manera confiable, rápida y fácil los compartimentos de varillas individuales es prometedora para revelar los procesos fisiológicos que ocurren en cada compartimento especializado y los mecanismos que subyacen a los procesos visuales en la salud y la enfermedad.
Para facilitar estas investigaciones, describimos dos métodos de peeling que aíslan los compartimentos subcelulares de los bastones más fácilmente que los protocolos actuales. El primer método de peeling, adaptado de una técnica para exponer células bipolares marcadas fluorescentemente para el registro de pinzas de parche21, emplea papel de filtro de celulosa para eliminar secuencialmente las ROS de una retina murina viva y aislada (Figura 1). El segundo método, adaptado de un procedimiento que aísla las tres capas primarias de células retinianas de una retina de pollito22 y rana23, utiliza cinta adhesiva para eliminar el ROS y el segmento interno del bastón (RIS) de una retina liofilizada (Figura 2). Ambos procedimientos se pueden completar en 1 h y son considerablemente fáciles de usar. Proporcionamos validación de la efectividad de estos dos protocolos de separación para western blot mediante la utilización de retinas adaptadas a la oscuridad y expuestas a la luz de ratones C57BL / 6J para demostrar la translocación inducida por la luz de la transducina de bastón (GNAT1) y la arrestina (ARR1). Además, utilizando el método de pelado en cinta, proporcionamos evidencia adicional de que nuestra técnica se puede utilizar para examinar y abordar las inconsistencias entre los datos de localización de proteínas adquiridos por inmunocitoquímica (ICC) y western blots. Específicamente, nuestra técnica mostró que: 1) la isoforma de la proteína quinasa C-alfa (PKCα) está presente no solo en células bipolares, sino también en ROS murinas y RIS, aunque en bajas concentraciones24,25, y 2) rodopsina quinasa (GRK1) está presente predominantemente en la muestra aislada de SG. Estos datos demuestran la efectividad de nuestras dos técnicas de peeling para separar y cuantificar proteínas específicas de bastones y retinales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muchas enfermedades de la retina afectan a las células fotorreceptoras de bastoncillos, lo que lleva a la muerte de los bastones y, en última instancia, a la pérdida completa de la visión37. Una parte significativa de los orígenes genéticos y mecanicistas de la degeneración retiniana humana se han recapitulado con éxito en numerosos modelos de ratones a lo largo de los años. En ese contexto, la capacidad de separar fácil y selectivamente los compartimentos subcelulares de bastoncillos in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH Grant EY12155, EY027193 y EY027387 a JC. Estamos agradecidos al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, EE.UU.) y Natalie Chen (USC, Los Ángeles, EE.UU.) por la revisión del manuscrito. También nos gustaría agradecer al Dr. Seth Ruffins (USC, Los Ángeles, EE.UU.) y al Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Ángeles, EE.UU.) por proporcionar el equipo necesario para recoger las imágenes proporcionadas por el autor. Material de: Kasey Rose et al, Separación de compartimentos de células fotorreceptoras en retina de ratón para análisis de proteínas, Molecular Neurodegeneration, publicado [2017], [Springer Nature].
Materials
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Referências
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