Två peelingmetoder för isolering av fotoreceptorcellfack i mus näthinnan för proteinanalys
Summary
Detta protokoll presenterar två tekniker för att isolera subcellulära fack av murine stång fotoreceptorer för protein analys. Den första metoden använder levande näthinne- och cellulosafilterpapper för att separera stångens yttre segment, medan den andra använder frystorkad näthinna och tejp för att skala bort stångens inre och yttre segmentskikt.
Abstract
Stångfotoreceptorer är mycket polariserade sensoriska nervceller med distinkta fack. Musstängerna är långa (~80 μm) och tunna (~2 μm) och packas i sidled i näthinnans yttersta lager, fotoreceptorskiktet, vilket resulterar i justering av analoga subcellulära fack. Traditionellt har tangentiell sektionering av den frusna plattmonterade näthinnan använts för att studera rörelse och lokalisering av proteiner inom olika stavfack. Den höga krökningen av den stavdominerande mushinnan gör dock tangentiell sektion utmanande. Motiverade av studien av proteintransport mellan fack utvecklade vi två peelingmetoder som på ett tillförlitligt sätt isolerar stångens yttre segment (ROS) och andra subcellulära fack för västra fläckar. Våra relativt snabba och enkla tekniker levererar berikade och subcellulära fraktioner för att kvantitativt mäta distribution och omfördelning av viktiga fotoreceptorproteiner i normala stavar. Dessutom kan dessa isoleringstekniker också enkelt anpassas för att isolera och kvantitativt undersöka proteinsammansättningen i andra cellulära skikt inom både friska och degenererande näthinnan.
Introduction
Stångfotoreceptorceller, tätt packade i det yttersta lagret av neural näthinnan, är en integrerad del av dim ljusseende. För att fungera som trogna fotonräknare använder stavar en G-proteinbaserad signalväg, så kallade fototransduktion, för att generera snabba, förstärkta och reproducerbara svar på en enda fotonfångst. Detta svar på ljus utlöser i slutändan en förändring i strömmen vid plasmamembranet och signaleras därefter till resten av det visuella systemet1. Som namnet antyder har varje stavcell en distinkt stavliknande form och uppvisar en mycket polariserad cellulär morfologi, bestående av ett yttre segment (OS), inre segment (IS), cellkropp (CB) och synaptisk terminal (ST). Varje subcellulärt fack har specifika proteinmaskiner (membranbunden och löslig), biomolekylära egenskaper och proteinkomplex som spelar avgörande roller som visuell fototransduktion, allmän hushållning och proteinsyntes och synaptisk överföring2,3.
För över 30 år sedan observerades den ljusberoende ömsesidiga rörelsen av subcellulära proteiner, särskilt transdukt (bort från operativsystemet) och arrestin (mot operativsystemet), först4,5,6,7. Tidigt mottogs detta observerade fenomen med skepsis, delvis på grund av immunohistokemis sårbarhet för epitopmaskering8. I början av 2000-talet bekräftades stimulansberoende protein flyttning med hjälp av en rigorös och mödosam fysisk sektionsteknik9. Seriell tangentiell avsnitt av frysta platt-monterade gnagare näthinnan följt av immunoblotting visade att transducin9,10, arrestin11,12 och recoverin13 alla genomgår subcellulära omfördelning som svar på ljus. Man tror att ljusdriven flyttning av dessa viktiga signalproteiner inte bara reglerar känsligheten hos fototransduktionskaskaden9,14,15, men kan också vara neuroprotektiva mot ljusskador16,17,18. Eftersom ljusdriven proteintransport i stavar verkar vara mycket betydelsefull för stavcellsbiologi och fysiologi, är tekniker som tillåter isolering av olika subcellulära fack för att bestämma proteinfördelning värdefulla forskningsverktyg.
För närvarande finns det några metoder som syftar till att isolera stångsubcellulära fack. Dessa metoder kan dock vara långa och svåra att reproducera, eller kräva en betydande mängd näthinneisolat. Stång yttre segment (ROS) preparat via densitet gradient centrifugation19, till exempel, används ofta för att separera ROS från retinal homogenate. Denna metod används ofta för västra blot, men förfarandet är mycket tidskrävande och kräver minst 8-12 murin retinae20. Å andra sidan har seriell tangentiell sektion av fryst murin och råtta näthinna framgångsrikt genomförts för att isolera operativsystemet, IS, CB och ST9,11,13. Denna metod är dock tekniskt utmanande på grund av behovet av att helt platta den lilla och mycket krökta murin näthinnan för att justera näthinnan lager före tangentiell avsnitting. Eftersom det finns en mängd musmodeller och transgena möss som rekapitulerar sjukdomar i det visuella systemet, är skapandet av en teknik som tillförlitligt, snabbt och enkelt separerar enskilda stavfack löfte om att avslöja de fysiologiska processer som förekommer i varje specialiserat fack och de mekanismer som ligger till grund för visuella processer inom hälsa och sjukdom.
För att underlätta dessa undersökningar beskriver vi två peeling metoder som isolerar stång subcellular fack lättare än nuvarande protokoll. Den första peelingmetoden, anpassad från en teknik för att exponera fluorescerande märkta bipolära celler för patchklämma inspelning21, använder cellulosafilterpapper för att sekventiellt ta bort ROS från en levande, isolerad murin näthinna (figur 1). Den andra metoden, anpassad från ett förfarande som isolerar de tre primära näthinnan celllagren från en chick22 och frog23 näthinna, använder tejp för att ta bort ROS och stav inre segment (RIS) från en frystorkad näthinna (figur 2). Båda procedurerna kan slutföras på 1 h och är betydligt användarvänliga. Vi ger validering av effektiviteten av dessa två separation protokoll för västra blot genom att använda mörk-anpassade och ljus-exponerade näthinnan från C57BL/6J möss att visa ljusinducerad flyttning av stång transducin (GNAT1) och arrestin (ARR1). Dessutom, med hjälp av tejp peeling metoden, vi ger ytterligare bevis för att vår teknik kan användas för att undersöka och ta itu med inkonsekvenser mellan protein lokalisering data förvärvas av immunocytochemistry (ICC) och västra blots. Specifikt visade vår teknik att: 1) proteinkinas C-alfa (PKCα) isoform finns inte bara i bipolära celler, men också i murin ROS och RIS, om än i låga koncentrationer24,25 och 2) rhodopsin kinas (GRK1) finns främst i det isolerade OS-provet. Dessa data visar effektiviteten av våra två peeling tekniker för att separera och kvantifiera specifika stav- och näthinneproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många retinala sjukdomar påverkar stångfotoreceptorceller, vilket leder till stavdöd och i slutändan fullständig synförlust37. En betydande del av de genetiska och mekanistiska ursprungen mänskliga retinal degeneration har framgångsrikt rekapitulerats i många musmodeller under åren. I det sammanhanget skulle förmågan att enkelt och selektivt separera enskilda stav subcellulära fack från den lilla mus näthinnan kraftigt öka vår förståelse av de lokaliserade biokemiska och moleky…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH Grant EY12155, EY027193 och EY027387 till JC. Vi är tacksamma mot Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) och Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) för korrekturläsning av manuskriptet. Vi vill också tacka Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) och Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) för att ha tillhandahållit nödvändig utrustning för att samla in författaren som tillhandahölls bilder. Material från: Kasey Rose et al, Separation av fotoreceptor cellfack i mus näthinnan för proteinanalys, Molecular Neurodegeneration, publicerad [2017], [Springer Nature].
Materials
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Referências
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neurociência. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
