Her præsenterer vi en modificeret metode til isolering og kultur af menneskelige gingivale epitelceller ved at tilføje Rock-hæmmeren, Y-27632, til den traditionelle metode. Denne metode er lettere, mindre tidskrævende, forbedrer stamcelleegenskaberne og producerer et større antal højpotentialede epitelceller både til laboratoriet og til kliniske anvendelser.
Den gingival væv er den første struktur, der beskytter paradentose væv og spiller meningsfulde roller i mange mundtlige funktioner. Gingival epitel er en vigtig struktur af gingivalt væv, især i reparation og regenerering af paradentosevæv. Undersøgelse af gingival epitelcellers funktioner har afgørende videnskabelig værdi, såsom reparation af orale defekter og detektering af biomaterialers kompatibilitet. Som menneskelige gingival epitelceller er meget differentierede keratiniserede celler, deres levetid er kort, og de er vanskelige at passere. Indtil videre er der kun to måder at isolere og kultur gingival epitelceller, en direkte explant metode og en enzymatisk metode. Men den tid, der kræves for at opnå epitelceller ved hjælp af den direkte explant metode er længere, og cellen overlevelsesraten for den enzymatiske metode er lavere. Klinisk er erhvervelsen af gingivalt væv begrænset, så der er behov for et stabilt, effektivt og simpelt in vitro-isolations- og kultursystem. Vi forbedrede den traditionelle enzymatiske metode ved at tilføje Y-27632, en Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer, som selektivt kan fremme væksten af epitelceller. Vores modificerede enzymatiske metode forenkler trinene i den traditionelle enzymatiske metode og øger effektiviteten af dyrkning af epitelceller, hvilket har betydelige fordele i forhold til den direkte explant-metode og den enzymatiske metode.
Den menneskelige gingiva, den første linje forsvarsstruktur, der beskytter paradentvæv, er ikke kun en fysisk og kemisk barriere1, men udskiller også forskellige klasser af inflammatoriske mæglere, der deltager i immunrespons og udgør en immunbarriere2,3. Den gingival epitel spiller en vigtig rolle i reparation og regenerering af paradentose væv. Derfor er det af stor betydning at studere gingival epitels forsvar og immunitet for at forstå forekomsten, diagnosen og behandlingen af parodontitis. Isolationen og kulturen af gingivale epitelceller fra human gingivalt væv er det første skridt, der kræves for at studere gingival epitel. En sådan procedure kræver grundlæggende operationer såsom fremstilling af frøceller til vævsteknik, in vitro-modeller af paradentose tilknyttede sygdomme og materialer til reparation af paradentosedefekter.
Primære gingival epitelceller er karakteriseret ved en lav division sats in vitro4, forskere har været på udkig efter en optimal isolation og dyrkning metode i årtier. Til dato er to forskellige teknikker, en direkte explant metode og en enzymatisk metode, almindeligt anvendt i laboratorier til at opnå primære gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkte explant metode har fordele såsom kravet om en lavere mængde vævsprøver og simpel isolationsprocedure, men det har ulemperne ved længere kulturtid og modtagelighed for forurening5. Selvom den enzymatiske metode forkorter den nødvendige kulturtid, er effektiviteten relativt lav og varierer afhængigt af de anvendte enzymer og medium. Kedjarune et al.6 viste, at den direkte explant metode, som kræver mere tid før subkultur (2 uger), syntes at være mere vellykket for dyrkning gingival epitelceller i forhold til den enzymatiske metode. Men ved at sammenligne disse to metoder fandt Klingbeil et al.7, at den enzymatiske metode havde de bedste resultater for primære kulturer af orale epitelceller, og det var muligt at opnå det optimale celleudbytte inden for den korteste periode (11,9 dage mod 14,2 dage).
Derfor var det vigtigt at udvikle en mere bekvem og effektiv metode til isolering og kultur af orale epitelceller4. Vi har tidligere rapporteret, at tilføje Y-27632, en hæmmer af Rho-associeret protein kinase (ROCK), forenkler isolationsproceduren for menneskelige primære epidermale celler og keratinocytter fra voksne hudvæv8,9,10. Vi udviklede G-medium, et nyt betinget podningsmedium, der spontant adskiller epidermale fra dermale celler og understøtter væksten og udbyttet af primære epidermale celler8,9,10. I dette studie udviklede vi en ny serumfri isolations- og kulturteknik til gingivale epitelceller ved at kombinere G-medium med Y-27632. I det væsentlige er vores metode baseret på en forenkling af den traditionelle totrins enzymatiske metode, så vi sammenlignede vores nye metode med den direkte explant-metode. Denne modificerede enzymatiske metode forkorter betydeligt den tid, der kræves for at adskille gingivale epitelceller fra gingivalt væv og øger effektiviteten af dyrkning af gingivale epitelceller.
Den gingival væv er en central struktur, der opretholder paradentose integritet og sundhed. Gingival epitelceller har betydelige roller i reparation og regenerering af paradentosevæv og kan anvendes i videnskabelig forskning og kliniske anvendelser og relaterede områder, herunder oral biologi, farmakologi, toksikologi, og mundslimhinden mangler18. Derfor er det nødvendigt at udvikle en stabil og effektiv metode til at høste orale epitelceller19. Primære epitelceller e…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program i Shandong-provinsen (2019GSF108107) til X.W.; det centrale forsknings- og udviklingsprogram i Shandong-provinsen (2018GSF118240) til J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) til Z.X., og Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2019WS045) til J.S.
Names | Abbreviations & Comments | ||
Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |