Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양
Summary
여기서 우리는 전통적인 방법에 록 억제제 Y-27632를 추가하여 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 변형된 방법을 제시한다. 이 방법은 더 쉽고 시간이 많이 걸리며 줄기 세포 특성을 향상시키며 실험실과 임상 응용 분야에서 더 많은 수의 고잠재 상피 세포를 생성합니다.
Abstract
gingival 조직은 치주 조직을 보호하고 많은 구강 기능에 있는 의미 있는 역할을 하는 첫번째 구조물입니다. gingival 상피는 치지항 조직의 중요한 구조, 특히 치주 조직의 수리 및 재생에서. gingival 상피 세포의 기능을 연구하는 것은 구강 결함을 복구하고 생체 재료의 호환성을 검출하는 것과 같은 중요한 과학적 가치가 있습니다. 인간 gingival 상피 세포는 높게 분화된 각질 세포이기 때문에, 그들의 수명은 짧고, 통과하기 어렵습니다. 지금까지, 분리 및 배양 gingival 상피 세포, 직접 절제 방법 및 효소 방법이 있는 두 가지 방법이 있습니다. 그러나, 직접 적인 절제 방법을 사용하여 상피 세포를 얻는 데 필요한 시간은 더 길고, 효소 방법의 세포 생존율은 낮다. 임상적으로, gingival 조직의 취득이 제한되어 있으므로 안정적이고 효율적이며 간단한 체외 격리 및 배양 시스템이 필요합니다. 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진할 수 있는 Rho-관련 키나아제(ROCK) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 전통적인 효소 방법을 개선했습니다. 당사의 변형된 효소 방법은 기존의 효소 방법의 단계를 단순화하고 직접 적인 절제 방법 및 효소 방법에 비해 상당한 이점을 갖는 상피 세포를 배양하는 효율성을 증가시킵니다.
Introduction
치주 조직을 보호하는 제1라인 방어 구조인 인간 칭기바는 물리적 및 화학적 장벽1일뿐만 아니라 면역 반응에 참여하고 면역 장벽2,3을구성하는 다양한 종류의 염증 중물질을 분비한다. gingival 상피는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을한다. 따라서, 칭기발 상피의 방어 및 면역을 공부하는 것은 치주염의 발생, 진단 및 처리를 이해하는 데 큰 의미가 있습니다. 인간 칭기질 조직에서 gingival 상피 세포의 격리 및 배양은 칭기발 상피를 연구하는 데 필요한 첫 번째 단계입니다. 이러한 절차는 조직 공학을 위한 종자 세포 생산, 치주 관련 질병의 체외 모델 및 치주 결함을 복구하기 위한 재료와 같은 기본적인 수술이 필요합니다.
1 차적인 gingival 상피 세포는 시험관 4에 있는낮은 분할 비율에 의해 특징지이며, 연구원은 수십 년 동안 최적 격리 및 재배 방법을 찾고 있습니다. 현재까지, 두 개의 상이한 기술, 직접 절제 방법 및 효소 방법, 일반적으로 시험관 4에서1차 칭기발 상피 세포를 얻기 위해 실험실에서 사용된다4,5. 직접 적인 절제 방법은 낮은 양의 조직 시편과 간단한 격리 절차의 요구 사항과 같은 장점을 가지고 있지만, 더 긴 배양 시간과 오염에 대한 감수성의 단점이5. 효소 방법은 필요한 배양 시간을 단축하지만, 효율은 상대적으로 낮으며 사용되는 효소 및 매체에 따라 다릅니다. Kedjarune외. 6 서브컬쳐 (2 주) 전에 더 많은 시간을 필요로 하는 직접 적인 절제 방법은 효소 방법에 비해 칭기발 상피 세포를 배양하는 데 더 성공한 것으로 나타났다. 그러나, 이들 두 가지 방법을 비교하면, 클링베일 외7은 효소 방법이 경구 상피 세포의 1차 배양에 가장 좋은 결과를 가져온 것으로 나타났으며, 최단 기간(11.9일 대 14.2일) 내에 최적의 세포 수율을 얻을 수 있었다.
따라서, 경구 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 보다 편리하고 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요했다4. 우리는 이전에 Y-27632, Rho 관련 단백질 키나아제 (ROCK)의 억제제, 성인 피부 조직에서 인간 1 차형 표피 세포 및 각질 세포의 격리 절차를 단순화한다는 것을보고8,9,10. 우리는 G-배지를 개발, 자발적으로 진피 세포에서 표피를 분리하고 1 차성 표피 세포의 성장과 수율을 지원하는 새로운 조건부 접종 배지8,9,10. 본 연구에서는 G-배지와 Y-27632를 결합하여 gingival 상피 세포를 위한 새로운 혈청 없는 격리 및 배양 기술을 개발했습니다. 본질적으로, 우리의 방법은 기존의 2 단계 효소 방법의 단순화를 기반으로, 그래서 우리는 직접 절제 방법과 우리의 새로운 방법을 비교했다. 이 수정된 효소 방법은 칭기발 조직으로부터 칭기발 상피 세포를 분리하는 데 필요한 시간을 현저히 단축하고 칭기발 상피 세포를 배양하는 효율을 증가시킵니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
gingival 조직은 치주 무결성 및 건강을 유지하는 중요한 구조입니다. Gingival 상피 세포는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을 하며 경구 생물학, 약리학, 독성학 및 구강 점막 결핍을 포함한 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 및 관련 분야에서 사용될 수 있다18. 따라서 경구상피세포(19)를수확하는 안정적이고 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다. 1 차상 세…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 산동성 자연과학재단(ZR2019ZD36)과 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램(2019GSF108107)에서 X.W.에 의해 지원되었습니다. 산동성 주요 연구 개발 프로그램 (2018GSF118240)에서 J.G.에; 산동성 의료보건과학기술개발사업(2018WS163)과 산동성 의료보건과학기술개발사업(2019WS045)
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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