实时监测细胞因子分化人原代T细胞中的线粒体呼吸
Summary
代谢适应是 T 细胞的基础，因为它决定了分化、持久性和细胞毒性。本文介绍了一种用于监测 离体 细胞因子分化的人原代T细胞中线粒体呼吸的优化方案。
Abstract
在激活过程中，T细胞的新陈代谢适应影响其命运的变化。线粒体氧化磷酸化的增加对于T细胞活化是必不可少的，而记忆T细胞的存活取决于线粒体重塑。因此，这会影响癌症免疫疗法的长期临床结果。T细胞质量的变化通常通过使用众所周知的表面标志物的流式细胞术进行研究，而不是直接通过其代谢状态进行研究。这是一种优化的方案，用于使用细胞外通量分析仪和细胞因子IL-2和IL-15测量原代人T细胞的实时线粒体呼吸，它们对T细胞代谢的影响不同。结果表明，通过测量抑制代谢途径中关键复合物时的耗氧量可以清楚地区分T细胞的代谢状态，并且这些测量的准确性高度依赖于最佳抑制剂浓度和抑制剂注射策略。这种标准化方案将有助于实施线粒体呼吸作为监测和研究癌症免疫疗法中T细胞适应性的标准。
Introduction
正确的T细胞发育和功能对于免疫系统识别和响应抗原的能力至关重要。线粒体氧化磷酸化（OxPhos）根据T细胞的状态而变化。幼稚T细胞主要使用OxPhos产生ATP，而活化的T细胞经历代谢转变，其中糖酵解成为主导1。在效应阶段之后，记忆T细胞的一小部分剩余子集恢复到由OxPhos2，3主导的代谢状态。OxPhos的变化跟随T细胞的分化到这样的程度，甚至T细胞的亚群也可以通过其特异性OxPhos特性来分化1。相反，OxPhos对T细胞的功能很重要，并且已经证明对OxPhos的抑制可以阻断T细胞的增殖和细胞因子产生4。因此，以精确和可重复的方式量化T细胞OxPhos特性的能力对于任何使用T细胞的人来说都是一个强大的工具。
在该协议中，使用细胞外通量分析仪测量T细胞OxPhos的性质。该分析仪的核心功能是连续测量待分析细胞生长培养基的氧含量。从生长培养基中除去的氧气被细胞吸收。通过用各种OxPhos抑制剂或修饰剂处理细胞，摄氧量的下降与抑制或调节的功能有关。例如，抑制ATP合酶将导致细胞对氧气的摄取减少，否则这些摄取将用于通过氧化磷酸化产生ATP。其他设备，包括Clark电极和Oroboros仪器，提供类似的功能，每种仪器都有不同的优点和缺点。多种细胞类型可用于这些设备的研究，但一种特别具有挑战性的细胞类型是人类原发性T淋巴细胞5。由于它们的体积小， 离体存活率差，并且不粘附特性，人类原代T细胞的研究可能具有挑战性。
这是通过细胞外分析仪研究人类原代T细胞线粒体呼吸的方案。该协议分为优化运行，其中确定每孔细胞数的最佳浓度以及寡霉素和FCCP的最佳浓度。此外，使用优化条件的测定运行。
使用血源性人 PBMC 和 离体 原代 T 细胞培养物，该协议证明了最佳抑制剂浓度的重要性，以及在处理敏感细胞类型时使用单独而不是顺序注射线粒体抑制剂的相关性。最后，证明该测定可以稳健地检测细胞因子IL-2和IL-15极化时线粒体呼吸的细微差异。
Protocol
Representative Results
Discussion
在描述T细胞的能量状态时，氧化磷酸化的详细和正确的定量是不可或缺的工具。线粒体适应状态可能与 T 细胞活化电位、存活和分化直接相关1，5。使用该协议，可以确定氧化磷酸化的各种性质（详见 表4 ）。精确定量氧化磷酸化的这些特性可以详细了解T细胞的能量状态。但是，为了获得可靠的结果，在设置实验时必须非常小心。
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard和Anne Rahbech获得了Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat的资助。Kasper Mølgaardals还获得了Børnecancerfonden的资助。
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
Referências
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