Real-time monitoring van mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen
Summary
Metabole aanpassing is fundamenteel voor T-cellen omdat het differentiatie, persistentie en cytotoxiciteit dicteert. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van mitochondriale ademhaling in ex vivo cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen.
Abstract
Tijdens de activering past het metabolisme van T-cellen zich aan aan veranderingen die hun lot beïnvloeden. Een toename van mitochondriale oxidatieve fosforylering is onmisbaar voor T-celactivatie en de overleving van geheugen-T-cellen is afhankelijk van mitochondriale remodellering. Bijgevolg beïnvloedt dit de klinische uitkomst op lange termijn van kankerimmunotherapieën. Veranderingen in T-celkwaliteit worden vaak bestudeerd door flowcytometrie met behulp van bekende oppervlaktemarkers en niet direct door hun metabolische toestand. Dit is een geoptimaliseerd protocol voor het meten van real-time mitochondriale ademhaling van primaire menselijke T-cellen met behulp van een Extracellulaire Flux Analyzer en de cytokines IL-2 en IL-15, die het T-celmetabolisme anders beïnvloeden. Het is aangetoond dat de metabole toestand van T-cellen duidelijk kan worden onderscheiden door het zuurstofverbruik te meten bij het remmen van belangrijke complexen in de metabole route en dat de nauwkeurigheid van deze metingen sterk afhankelijk is van een optimale remmerconcentratie en remmerinjectiestrategie. Dit gestandaardiseerde protocol zal helpen bij het implementeren van mitochondriale ademhaling als een standaard voor T-celfitness bij het monitoren en bestuderen van kankerimmunotherapieën.
Introduction
Correcte ontwikkeling en functie van T-cellen zijn essentieel voor het vermogen van het immuunsysteem om antigenen te herkennen en erop te reageren. Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OxPhos) verandert afhankelijk van de toestand van de T-cel. Naïeve T-cellen gebruiken voornamelijk OxPhos om ATP te produceren, terwijl geactiveerde T-cellen een metabole overgang ondergaan waarbij glycolyse dominant wordt1. Na de effectorfase keert de kleine resterende subset van geheugen-T-cellen terug naar een metabolische toestand die wordt gedomineerd door OxPhos2,3. De veranderingen van OxPhos volgen de differentiatie van T-cellen in zo’n mate dat zelfs subsets van T-cellen kunnen worden gedifferentieerd door hun specifieke OxPhos-eigenschappen1. Omgekeerd is OxPhos belangrijk voor de functie van T-cellen en is aangetoond dat remming van OxPhos proliferatie en cytokineproductie van T-cellen blokkeert4. Daarom is de mogelijkheid om de eigenschappen van T-cel OxPhos op een nauwkeurige en reproduceerbare manier te kwantificeren een krachtig hulpmiddel voor iedereen die met T-cellen werkt.
In dit protocol worden de eigenschappen van T-cel OxPhos gemeten met behulp van een extracellulaire flux analyzer. De kernfunctie van deze analyzer is het continu meten van het zuurstofgehalte van de groeimedia van de te analyseren cellen. Zuurstof verwijderd uit de groeimedia wordt verondersteld te worden opgenomen door de cellen. Door de cellen te behandelen met een verscheidenheid aan OxPhos-remmers of modifiers, wordt een daling van de zuurstofopname geassocieerd met de geremde of gemoduleerde functie. Remming van het ATP-synthase zal bijvoorbeeld leiden tot een verminderde cellulaire opname van zuurstof die anders zou worden gebruikt om ATP te produceren door oxidatieve fosforylering. Andere apparatuur, waaronder de Clark-elektrode en het Oroboros-instrument, biedt vergelijkbare functionaliteit en elk instrument heeft verschillende voordelen en tekortkomingen. Een breed scala aan celtypen kan worden gebruikt voor studies in deze apparaten, maar een bijzonder uitdagend celtype is menselijke primaire T-lymfocyten5. Vanwege hun kleine formaat, slechte overleving ex vivo en niet-adherente eigenschappen, kunnen menselijke primaire T-cellen een uitdaging zijn om te bestuderen.
Dit is een protocol voor het bestuderen van de mitochondriale ademhaling van menselijke primaire T-cellen door een extracellulaire analysator. Het protocol is verdeeld in een Optimalisatie run, waarbij optimale concentraties van celgetal per put, evenals de optimale concentratie van oligomycine en FCCP, worden bepaald. Verder wordt er een Assay uitgevoerd, waarbij de geoptimaliseerde condities worden gebruikt.
Met behulp van bloed-afgeleide menselijke PBMC’s en ex vivo primaire T-celculturen, toont dit protocol het belang aan van een optimale remmerconcentratie en de relevantie van het gebruik van afzonderlijke in plaats van een sequentiële injectie van mitochondriale remmers bij het werken met gevoelige celtypen. Ten slotte is aangetoond dat deze test robuuste subtiele verschillen in mitochondriale ademhaling kan detecteren bij polarisatie met cytokines IL-2 en IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gedetailleerde en correcte kwantificering van oxidatieve fosforylering is een onmisbaar hulpmiddel bij het beschrijven van de energietoestanden van T-cellen. De toestand van mitochondriale fitheid kan direct verband houden met T-celactivatiepotentieel, overleving en differentiatie1,5. Met dit protocol is het mogelijk om de verschillende eigenschappen van oxidatieve fosforylering te bepalen (zie tabel 4 voor een gedetailleerde uitleg). Nauwkeurige…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard en Anne Rahbech ontvingen subsidies van Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard ontving ook een subsidie van Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
Referências
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
