Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.
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Artigo de método
Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros
Neste artigo
Resumo
Resumo
O organoide cerebral derivado do iPSC é uma tecnologia promissora para modelar in vitro as patologias do sistema nervoso e o rastreamento de drogas. Essa tecnologia surgiu recentemente. Ainda está em sua infância e ainda tem algumas limitações não resolvidas. Os protocolos atuais não permitem que a obtenção de organoides seja consistente o suficiente para a descoberta de drogas e estudos pré-clínicos. O amadurecimento dos organoides pode levar até um ano, pressionando os pesquisadores a lançar múltiplos processos de diferenciação simultaneamente. Impõe custos adicionais para o laboratório em termos de espaço e equipamentos. Além disso, organoides cerebrais geralmente têm uma zona necrosada no centro, que sofre de deficiência de nutrientes e oxigênio. Assim, a maioria dos protocolos atuais utiliza um sistema circulante para o meio cultural para melhorar a nutrição.
Enquanto isso, não há sistemas dinâmicos baratos ou bioreatores para o cultivo organoide. Este artigo descreve um protocolo para a produção de organoides cerebrais em minirepartores caseiros compactos e baratos. Este protocolo permite a obtenção de organoides de alta qualidade em grandes quantidades.
Introdução
Modelos derivados do iPSC humano são amplamente utilizados nos estudos de distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos1. Na última década, modelos de tecido cerebral 3D, os chamados organoides cerebrais, essencialmente complementaram as culturas neuronais 2D tradicionais2. Os organoides recapitulam até certo ponto a arquitetura 3D do cérebro embrionário e permitem uma modelagem mais precisa. Muitos protocolos são publicados para a geração de organoides representando diferentes regiões cerebrais: córtex cerebral3,4,5,....
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Protocolo
NOTA : Utilize técnica estéril em todo o protocolo, excluindo as etapas 1.2 e 1.3. Aqueça todos os meios de cultura e soluções a 37 °C antes de aplicar em células ou organoides. Cultivar células em uma incubadora de CO2 a 37 °C em 5% de CO2 em 80% de umidade. O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1.
1. Transformando placas de Petri em mini bioreatores
- Corte tubos de centrífugas estéreis de 15 mL em anéis de 7-8 mm de altura; autoclave os anéis.
- Quebre a baixa adesão, placas de Petri não tratadas ou microbiológicas em migalhas. Dissolva cerca de 1 ....
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Resultados
O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo incluiu cinco mídias nas quais os iPSCs se diferenciaram em organoides cerebrais durante pelo menos um mês. A diferenciação foi iniciada, então os iPSCs atingiram a confluência de 75-90% (Figura 2A,B). Os primeiros sinais de diferenciação em relação aos neurônios foram observados nos dias 10-11 do cultivo do iPSC no médio A, quando as células começaram a se agrupar em "rosetas"
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Discussão
O protocolo descrito tem duas etapas cruciais que permitem a geração de organoides de alta qualidade de tamanho uniforme. Primeiro, os organoides crescem a partir de esferoides que são quase idênticos no número celular e na maturidade celular. Em segundo lugar, os bioreatores caseiros fornecem a cada organoide um ambiente uniforme, onde organoides não se aglomeram ou se mantêm unidos.
A qualidade celular e o estado de maturação celular são essenciais para a execução do protocolo. É fundamental.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela subvenção 075-15-2019-1669 do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa (análise RT-PCR) e pela concessão nº 19-15-00425 da Fundação Russa de Ciência (para todos os outros trabalhos). Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | Placa de cultura de 24 poços com micropoços |
| Suplemento B-27 | Suplemento | Gibco 17504044 | Neuronal B |
| Suplemento GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanil-L-glutamina |
| BDNF humano | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Humano FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Humano GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Substituição | de Soro Gibco | 10828028 | Substituição de Soro |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Meio de células-tronco pliripotentes |
| N2 Suplemento | Gibco | ||
| Meio Neurobasal | Gibco | 21103049 | Meio basal para manutenção das células neuronais |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobianos |
| Purmorlamina | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Solução Trypan Blue | Gibco | 15250061 | |
| Solução Versen | Gibco | 15040066 | EDTA 0,48 mM em PBS |
| β-mercaptoetanol | Gibco | 31350010 |
Referências
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
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Reimpressões e permissões
