वयस्क मच्छर लार ग्रंथि (एसजी) वायरस और परजीवी सहित उनके मानव मेजबानों को सभी मच्छर जनित रोगजनकों के संचरण के लिए आवश्यक है। यह वीडियो लार्वा (एल 4) चरण एनोफिलीज़ गाम्बिया मच्छरों से एसजी के कुशल अलगाव और आगे के विश्लेषण के लिए एल 4 एसजी की तैयारी को दर्शाता है।
मच्छर लार ग्रंथियां (एसजी) कीट जनित रोगजनकों के संचरण के लिए एक आवश्यक प्रवेश द्वार अंग हैं। वायरस और प्लास्मोडियम परजीवी सहित रोग पैदा करने वाले एजेंट, जो मलेरिया का कारण बनते हैं, एसजी कोशिकाओं के स्रावी गुहाओं में जमा होते हैं। यहां, वे बाद के रक्त भोजन के दौरान अपने कशेरुकी मेजबानों को संचरण के लिए तैयार हैं। जैसा कि वयस्क ग्रंथियां लार्वा एसजी डक्ट बड अवशेषों के विस्तार के रूप में बनती हैं जो शुरुआती प्यूपल एसजी हिस्टोलिसिस से परे बनी रहती हैं, लार्वा एसजी हस्तक्षेप के लिए एक आदर्श लक्ष्य है जो रोग संचरण को सीमित करता है। लार्वा एसजी विकास को समझना इसकी आकृति विज्ञान और कार्यात्मक अनुकूलन की बेहतर समझ विकसित करने में मदद कर सकता है और इस अंग को लक्षित करने वाले नए हस्तक्षेपों के मूल्यांकन में सहायता कर सकता है। यह वीडियो प्रोटोकॉल एनोफिलीज़ गाम्बियाई मच्छरों से लार्वा एसजी को अलग करने, ठीक करने और धुंधला करने के लिए एक कुशल तकनीक को दर्शाता है। 25% इथेनॉल समाधान में लार्वा से विच्छेदित ग्रंथियों को मेथनॉल-ग्लेशियल एसिटिक एसिड मिश्रण में तय किया जाता है, जिसके बाद एक ठंडा एसीटोन वॉश होता है। फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में कुछ कुल्ला करने के बाद, एसजी को एसजी-व्यक्त प्रोटीन के खिलाफ मार्कर रंजक और / या एंटीसेरा की एक विस्तृत सरणी के साथ दाग दिया जा सकता है। लार्वा एसजी अलगाव के लिए इस विधि का उपयोग सीटू संकरण विश्लेषण, अन्य ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुप्रयोगों और प्रोटिओमिक अध्ययनों के लिए ऊतक एकत्र करने के लिए भी किया जा सकता है।
मलेरिया एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा है जो 2019 में लगभग 230 मिलियन संक्रमण और अनुमानित 409,000 मौतों का कारण बनताहै। अधिकांश मौतें उप-सहारा अफ्रीका में होती हैं और परजीवी प्लास्मोडियम फाल्सीपेरमके कारण होती हैं, जिसका कीट वेक्टर एनोफिलीज़ गाम्बियाहै, जो इस वीडियो प्रदर्शन का विषय है। यद्यपि संख्याएं सदी के अंत के बाद से वार्षिक मृत्यु दर में एक महत्वपूर्ण गिरावट का संकेत देती हैं (>300,000 कम वार्षिक मौतें), 2000 से 2015 तक देखी गई रोग दर में आशाजनक कमी टेपरिंग हैं, जो रोग संचरण को सीमित करने के लिए नएदृष्टिकोणोंकी आवश्यकता का सुझाव देती हैं। मलेरिया को नियंत्रित करने और संभवतः समाप्त करने के लिए आशाजनक अतिरिक्त रणनीतियों में CRISPR / Cas9-आधारित जीन-संपादनऔर जीन-ड्राइव3,4,5का उपयोग करके मच्छर वेक्टर क्षमता को लक्षित करना है। वास्तव में, यह मच्छर वेक्टर का लक्ष्यीकरण है (लंबे समय तक चलने वाले कीटनाशक-उपचारित बेड नेट के विस्तारित उपयोग के माध्यम से) जिसका रोगसंचरणको कम करने पर सबसे बड़ा प्रभाव पड़ा है।
मादा मच्छर रक्त भोजन के दौरान एक संक्रमित मानव से प्लास्मोडियम गैमेटोसाइट्स प्राप्त करते हैं। निषेचन, परिपक्वता, मिडगट एपिथेलियम ट्रैवर्सल, जनसंख्या विस्तार, और हेमोकोल नेविगेशन के बाद उनके बाध्य मच्छर मेजबानों में, सैकड़ों से दसियों हजारों प्लास्मोडियम स्पोरोजोइट्स मच्छर एसजी पर आक्रमण करते हैं और घटक स्रावी कोशिकाओं की स्रावी गुहाओं को भरते हैं। एक बार स्रावी गुहाओं के अंदर, परजीवी लार नलिका तक सीधी पहुंच रखते हैं और इस प्रकार अगले रक्त भोजन पर एक नए कशेरुक मेजबान को संचरण के लिए तैयार होते हैं। क्योंकि एसजी अपने मानव मेजबानों के लिए मलेरिया पैदा करने वाले स्पोरोज़ोइट्स के संचरण के लिए महत्वपूर्ण हैं, और प्रयोगशाला अध्ययनों से पता चलता है कि एसजी रक्त-आहार, मच्छर के अस्तित्व, या प्रजनन क्षमता7,8,9के लिए आवश्यक नहीं हैं, वे संचरण-अवरुद्ध उपायों के लिए एक आदर्श लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। वयस्क मच्छर एसजी लार्वा एसजी में “डक्ट कली” अवशेषों के विस्तार के रूप में बनते हैं जो शुरुआती पिल्ला एसजी हिस्टोलिसिस10से परे बने रहते हैं, जिससे लार्वा एसजी वयस्क-चरण रोग संचरण को सीमित करने के लिए हस्तक्षेप के लिए एक आदर्श लक्ष्य बन जाता है।
एसजी विकास के लार्वा चरण की विशेषता न केवल इसकी आकृति विज्ञान और कार्यात्मक अनुकूलन की बेहतर समझ विकसित करने में मदद कर सकती है, बल्कि नए हस्तक्षेपों का आकलन करने में भी मदद कर सकती है जो प्रमुख एसजी नियामकों के जीन संपादन के माध्यम से इस अंग को लक्षित करती हैं। चूँकि लार्वा लार ग्रंथि वास्तुकला के पिछले सभी अध्ययनों में इम्यूनोस्टेनिंग और आधुनिक इमेजिंगतकनीकों 10,11को पूर्वनिर्धारित किया गया है,इसलिए हमने लार ग्रंथियों को विभिन्न प्रकार के एंटीबॉडी और सेलमार्करोंके साथ अलग करने और धुंधला करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह वीडियो निष्कर्षण, निर्धारण, और confocal इमेजिंग के लिए Anopheles gambiae L4 लार्वा से लार्वा SGs के धुंधला करने के लिए इस दृष्टिकोण को दर्शाता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल को ड्रोसोफिला एसजी विच्छेदन प्रोटोकॉल और एक वयस्क मच्छर विच्छेदन प्रोटोकॉल14 , 15,16से अनुकूलित किया गया था । हालांकि, वयस्क विच्छेदन और एसजी धुं?…
The authors have nothing to disclose.
हम जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट को एन गाम्बिया लार्वा तक पहुंच और पालन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |