아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅
Summary
성인 모기 침샘 (SG)은 바이러스와 기생충을 포함하여 모든 모기 매개 병원균을 인간 숙주에게 전염시키는 데 필요합니다. 이 비디오는 애벌레 (L4) 단계 Anopheles 감비아모기에서 SGs의 효율적인 격리와 추가 분석을 위한 L4 SGs의 준비를 보여줍니다.
Abstract
모기 침샘 (SGs)은 곤충 매개 병원체의 전송을 위한 필수 게이트웨이 기관입니다. 말라리아를 일으키는 원인이 되는 바이러스 및 Plasmodium 기생충을 포함하여 질병을 일으키는 에이전트는, SG 세포의 분비 구멍에 축적됩니다. 여기에서, 그(것)들은 후속 혈액 식사 도중 그들의 척추 동물 호스트에게 전송을 위한 태세입니다. 성인 땀샘이 초기 pupal SG 히스토시스를 넘어 지속되는 애벌레 SG 덕트 싹 잔재의 정교화로 형성됨에 따라, 애벌레 SG는 질병 전염을 제한하는 내정간섭을 위한 이상적인 표적입니다. 애벌레 SG 개발을 이해하면 형태학과 기능적응에 대한 이해를 높이고 이 장기를 대상으로 하는 새로운 개입 평가에 도움이 될 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 Anopheles 감비아 모기에서 애벌레 SGs를 분리, 고정 및 염색하는 효율적인 기술을 보여줍니다. 25% 에탄올 용액으로 애벌레에서 해부된 땀샘은 메탄올 빙하 아세트산 혼합물에 고정되고 차가운 아세톤 세척이 뒤따릅니다. 인산염 완충식식염수(PBS)에서 몇 가지 헹구면 SG는 SG 발현 단백질에 대한 광범위한 마커 염료 및/또는 항세라로 염색될 수 있습니다. 애벌레 SG 절연을 위한 이 방법은 또한 시투 혼성화 분석, 그밖 전사 응용 프로그램 및 proteomic 연구 결과에 있는 조직을 수집하는 것을 이용될 수 있었습니다.
Introduction
말라리아는 2019년 1년에 거의 2억 3천만 건의 감염과 추정된 409,000명의 죽음을 일으키는 원인이 되는 중요한 공중 위생위협입니다. 사망자의 대부분은 사하라 사막 이남아프리카에 있으며, 곤충 벡터가 아노펠스 감비아인기생충 플라스모듐 팔시파룸에의해 발생하며, 이 비디오 데모의 주제입니다. 이 수치는 세기의 전환기 이후 연간 사망률이 현저한 감소(>300,000명 감소), 2000년부터 2015년까지 관찰된 질병 비율의 유망한 감소는 가늘어지며, 질병전염을제한하는 새로운 접근법의 필요성을 시사합니다 2. 말라리아를 통제하고 가능하게 제거하기 위한 유망한 추가 전략 중 CRISPR/Cas9 기지를 둔 유전자 편집 및 유전자 드라이브3,4,5를사용하여 모기 벡터 용량을 표적으로 하는 것입니다. 실제로, 질병전염감소에 가장 큰 영향을 미쳤던 모기 벡터(오래 지속되는 살충제 처리된 침대 그물의 확장된 사용을 통해)의 표적화이다 6.
여성 모기는 혈액 식사 도중 감염된 인간에게서 플라스모듐 게임토사이클을 취득합니다. 수정, 성숙, 미드구트 상피 통과, 인구 확장 및 헤모코엘 항비에 이어 수백 에서 수만 개의 플라스모듐 스포로조이트가 모기 SGs를 침범하고 구성 분비 세포의 분비 충치를 채웁니다. 일단 분비 구멍 안쪽에, 기생충은 침골 덕트에 직접 접근할 수 있고 이렇게 다음 혈액 식사에 새로운 척추 동물 호스트로 전송을 위한 태세입니다. SGs는 말라리아를 일으키는 산포로조이트를 인간 호스트에게 전달하는 데 중요하기 때문에, 실험실 연구에 따르면 SGs는 혈액 공급, 모기 생존 또는 fecundity7,8,9에필수적이지 않다고제안하며,전송 차단 측정을 위한 이상적인 표적을 나타냅니다. 성인 모기 SGs는 초기 pupal SG 히스토시스10을넘어 지속되는 애벌레 SGs의 “덕트 싹”잔재의 정교화로 형성되어 애벌레 SG가 성인 단계 질병 전염을 제한하는 중재를위한 이상적인 표적이됩니다.
SG 발달의 애벌레 단계를 특성화하면 형태와 기능적 적응에 대한 더 나은 이해를 개발할 뿐만 아니라 주요 SG 조절기의 유전자 편집을 통해 이 기관을 대상으로 하는 새로운 개입을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 애벌레 침샘 건축의 모든 이전 연구는 면역 염색 및 현대 이미징 기술10,11을선행하기 때문에, 우리는 다양한 항체 및 세포마커(12)를가진 타액 샘을 분리하고 염색하기위한 프로토콜을 개발하였다. 이 비디오는 공초점 화상 진찰을 위한 Anopheles 감비아E L4 애벌레에서 애벌레 SGs의 추출, 고정 및 염색에 이 접근을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에서 기재된 프로토콜은 Drosophila SG 해부 프로토콜 및 성인 모기 해부프로토콜(14,15,16)으로부터적응되었다. 그러나, 대부분의 마커는 성인 해부 및 SG 염색 방법을 사용할 때 지하 멤브레인(도시되지 않은 데이터)을 관통하지 않았다. 성인 프로토콜의 적응은 25% EtOH 용액에서 땀샘을 해부하고, MeOH와 빙하 아세트산의 조…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 안감비아애 애벌레에 접근하고 양육한 존스 홉킨스 말라리아 연구소에 감사드립니다.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referências
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