Dissectie en immunostaining van larvale speekselklieren van Anopheles gambiae muggen
Summary
De speekselklier van volwassen muggen (SG) is vereist voor de overdracht van alle door muggen overgedragen pathogenen naar hun menselijke gastheren, inclusief virussen en parasieten. Deze video toont een efficiënte isolatie van de SG’s van de larvale (L4) stadium Anopheles gambiae muggen en de voorbereiding van de L4 SG’s voor verdere analyse.
Abstract
Muggen speekselklieren (SG’s) zijn een noodzakelijk toegangspoortorgaan voor de overdracht van door insecten overgedragen pathogenen. Ziekteverwekkende stoffen, waaronder virussen en de Plasmodium-parasieten die malaria veroorzaken, hopen zich op in de secretoire holtes van SG-cellen. Hier zijn ze klaar voor overdracht naar hun gewervelde gastheren tijdens een volgende bloedmaaltijd. Omdat volwassen klieren zich vormen als een uitwerking van larvale SG-kanaalknopresten die na de vroege pop SG-histolyse blijven bestaan, is de larvale SG een ideaal doelwit voor interventies die de overdracht van ziekten beperken. Inzicht in de ontwikkeling van larvale SG kan helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van de morfologie en functionele aanpassingen en helpen bij de beoordeling van nieuwe interventies die zich op dit orgaan richten. Dit videoprotocol demonstreert een efficiënte techniek voor het isoleren, fixeren en kleuren van larvale SL’s van Anopheles gambiae muggen. Klieren ontleed van larven in een 25% ethanoloplossing worden gefixeerd in een methanol-glaciaal azijnzuurmengsel, gevolgd door een koude acetonwassing. Na een paar spoelingen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), kunnen SG’s worden gekleurd met een breed scala aan markerkleurstoffen en / of antisera tegen SG-uitgedrukte eiwitten. Deze methode voor larvale SG-isolatie kan ook worden gebruikt om weefsel te verzamelen voor in situ hybridisatieanalyse, andere transcriptomische toepassingen en proteomische studies.
Introduction
Malaria is een grote bedreiging voor de volksgezondheid en veroorzaakt bijna 230 miljoen infecties en naar schatting 409.000 sterfgevallen in 20191. De meeste sterfgevallen zijn in Sub-Sahara Afrika en worden veroorzaakt door de parasiet Plasmodium falciparum, waarvan de insectenvector Anopheles gambiaeis, het onderwerp van deze videodemonstratie. Hoewel de cijfers wijzen op een aanzienlijke daling van het jaarlijkse sterftecijfer sinds de eeuwwisseling (>300.000 minder jaarlijkse sterfgevallen), nemen de veelbelovende dalingen van de ziektecijfers waargenomen van 2000 tot 2015 af, wat suggereert dat er behoefte is aan nieuwe benaderingen om de overdracht van ziekten te beperken2. Een van de veelbelovende aanvullende strategieën voor het beheersen en mogelijk elimineren van malaria is het richten op de capaciteit van muggenvectoren met behulp van CRISPR / Cas9-gebaseerde genbewerking en gene-drive3,4,5. Het is inderdaad de targeting van de muggenvector (door het uitgebreide gebruik van langdurige met insecticide behandelde klamboes) die de grootste impact heeft gehad op het verminderen van ziekteoverdracht6.
Vrouwelijke muggen verwerven Plasmodium-gametocyten van een geïnfecteerde mens tijdens een bloedmaaltijd. Na bevruchting, rijping, midgut epitheel traversal, populatie-uitbreiding en hemocoelnavigatie in hun obligate muggengastheren, dringen honderden tot tienduizenden Plasmodium-sporozoïeten de mug-SG’s binnen en vullen de secretoire holtes van de samenstellende secretoire cellen. Eenmaal in de secretoire holtes hebben de parasieten directe toegang tot het speekselkanaal en zijn ze dus klaar voor overdracht naar een nieuwe gewervelde gastheer bij het volgende bloedmaal. Omdat SG’s van cruciaal belang zijn voor de overdracht van malaria-veroorzakende sporozoïeten naar hun menselijke gastheren, en laboratoriumstudies suggereren dat SG’s niet essentieel zijn voor bloedvoeding, muggenoverleving of vruchtbaarheid7,8,9, vormen ze een ideaal doelwit voor transmissieblokkerende maatregelen. Volwassen mug SG’s vormen zich als een uitwerking van “kanaalknop” overblijfselen in de larvale SG’s die blijven bestaan na vroege pop SG histolysis10, waardoor de larvale SG een ideaal doelwit is voor interventies om de overdracht van ziekten in een volwassen stadium te beperken.
Het karakteriseren van het larvale stadium van SG-ontwikkeling kan niet alleen helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van de morfologie en functionele aanpassingen, maar kan ook helpen bij het beoordelen van nieuwe interventies die zich op dit orgaan richten door genbewerking van belangrijke SG-regulatoren. Omdat alle eerdere studies van larvale speekselklierarchitectuur dateren van vóór immunostaining en moderne beeldvormingstechnieken10,11, hebben we een protocol ontwikkeld voor het isoleren en kleuren van speekselklieren met een verscheidenheid aan antilichamen en celmarkers12. Deze video demonstreert deze benadering van de extractie, fixatie en kleuring van larvale SL’s uit Anopheles gambiae L4-larven voor confocale beeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierin beschreven protocol is aangepast van een Drosophila SG dissectieprotocol en een volwassen muggendissectieprotocol14,15,16. De meeste markers drongen echter niet door het keldermembraan (gegevens niet getoond) bij gebruik van de volwassen dissectie- en SG-kleuringsmethoden. Aanpassingen van het volwassen protocol omvatten het ontleden van de klieren in een 25% EtOH-oplossing, het wassen van de klieren met een combinati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen het Johns Hopkins Malaria Research Institute bedanken voor de toegang tot en het fokken van An. gambiae larven.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referências
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
