Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens
Summary
La glande salivaire (SG) du moustique adulte est nécessaire pour la transmission de tous les agents pathogènes transmis par les moustiques à leurs hôtes humains, y compris les virus et les parasites. Cette vidéo démontre l’isolement efficace des SG des moustiques anophèles gambiens au stade larvaire (L4) et la préparation des SG L4 pour une analyse plus approfondie.
Abstract
Les glandes salivaires des moustiques (SG) sont un organe passerelle nécessaire à la transmission d’agents pathogènes transmis par les insectes. Les agents pathogènes, y compris les virus et les parasites Plasmodium qui causent le paludisme, s’accumulent dans les cavités sécrétoires des cellules SG. Ici, ils sont prêts à être transmis à leurs hôtes vertébrés lors d’un repas de sang ultérieur. Comme les glandes adultes se forment comme une élaboration de restes de bourgeons de canal SG larvaire qui persistent au-delà de l’histolyse SG nymphale précoce, la SG larvaire est une cible idéale pour les interventions qui limitent la transmission de la maladie. Comprendre le développement de la SG larvaire peut aider à mieux comprendre sa morphologie et ses adaptations fonctionnelles et aider à l’évaluation de nouvelles interventions qui ciblent cet organe. Ce protocole vidéo démontre une technique efficace pour isoler, fixer et colorer les SG larvaires des moustiques anophèles gambiens. Les glandes disséquées des larves dans une solution d’éthanol à 25% sont fixées dans un mélange méthanol-acide acétique glacial, suivi d’un lavage à froid à l’acétone. Après quelques rinçages dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les SG peuvent être colorés avec un large éventail de colorants marqueurs et / ou d’antisérums contre les protéines exprimées en SG. Cette méthode d’isolement de sg larvaire pourrait également être utilisée pour prélever des tissus pour l’analyse d’hybridation in situ, d’autres applications transcriptomiques et des études protéomiques.
Introduction
Le paludisme est une menace majeure pour la santé publique causant près de 230 millions d’infections et environ 409 000 décès en 20191. La majorité des décès se trouvent en Afrique subsaharienne et sont causés par le parasite Plasmodium falciparum,dont l’insecte vecteur est Anopheles gambiae,qui fait l’objet de cette démonstration vidéo. Bien que les chiffres indiquent une baisse significative du taux de mortalité annuel depuis le début du siècle (300 000 décès annuels de moins >), les baisses prometteuses des taux de mortalité observées de 2000 à 2015 s’estompent, ce qui suggère la nécessité de nouvelles approches pour limiter la transmission de la maladie2. Parmi les stratégies supplémentaires prometteuses pour contrôler et éventuellement éliminer le paludisme, il y a le ciblage de la capacité des moustiques vecteurs à l’aide de l’édition de gènes basée sur CRISPR / Cas9 et du forçagede gènes 3,4,5. En effet, c’est le ciblage du moustique vecteur (grâce à l’utilisation accrue de moustiquaires imprégnées d’insecticide de longue durée) qui a eu le plus grand impact sur la réduction de la transmission des maladies6.
Les moustiques femelles acquièrent des gamétocytes de Plasmodium d’un humain infecté lors d’un repas de sang. Après la fécondation, la maturation, la traversée de l’épithélium de l’intestin moyen, l’expansion de la population et la navigation de l’hémocèle chez leurs hôtes moustiques obligatoires, des centaines à des dizaines de milliers de sporozoïtes de Plasmodium envahissent les SG de moustiques et remplissent les cavités sécrétoires des cellules sécrétoires constitutives. Une fois à l’intérieur des cavités sécrétoires, les parasites ont un accès direct au canal salivaire et sont donc prêts à être transmis à un nouvel hôte vertébré lors du prochain repas sanguin. Parce que les SG sont essentiels à la transmission des sporozoïtes responsables du paludisme à leurs hôtes humains, et que des études de laboratoire suggèrent que les SG ne sont pas essentiels à l’alimentation sanguine, à la survie des moustiques ou à la fécondité7,8,9,ils représentent une cible idéale pour les mesures de blocage de la transmission. Les SG de moustiques adultes se forment comme une élaboration de restes de « bourgeons de canal » dans les SG larvaires qui persistent au-delà de l’histolyse SG nymphale précoce10, faisantde la SG larvaire une cible idéale pour les interventions visant à limiter la transmission de la maladie au stade adulte.
La caractérisation du stade larvaire du développement de la SG peut aider à développer non seulement une meilleure compréhension de sa morphologie et de ses adaptations fonctionnelles, mais peut également aider à évaluer de nouvelles interventions qui ciblent cet organe grâce à l’édition de gènes de régulateurs clés de la SG. Parce que toutes les études antérieures sur l’architecture des glandes salivaires larvaires sont antérieures à l’immunocoloration et aux techniques d’imagerie modernes10,11, nous avons développé un protocole pour isoler et colorer les glandes salivaires avec une variété d’anticorps et de marqueurs cellulaires12. Cette vidéo démontre cette approche de l’extraction, de la fixation et de la coloration des SG larvaires des larves d’Anopheles gambiae L4 pour l’imagerie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici a été adapté d’un protocole de dissection de Drosophila SG et d’un protocole de dissection de moustique adulte14,15,16. Cependant, la plupart des marqueurs n’ont pas pénétré dans la membrane basale (données non présentées) lors de l’utilisation des méthodes de dissection adulte et de coloration SG. Les adaptations du protocole adulte comprenaient la dissection des glandes dans une solut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Johns Hopkins Malaria Research Institute pour l’accès et l’élevage des larves d’An. gambiae.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referências
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
