A glândula salivar de mosquito adulto (SG) é necessária para a transmissão de todos os patógenos transmitidos por mosquitos para seus hospedeiros humanos, incluindo vírus e parasitas. Este vídeo demonstra o isolamento eficiente das OGs do estágio larval (L4) dos mosquitos Anopheles gambiae e a preparação dos SGs L4 para análise posterior.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Dissecção e Imunostaining de Glândulas Salivares Larvais de Anopheles gambiae Mosquitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As glândulas salivares de mosquitos (OG) são um órgão de entrada necessário para a transmissão de patógenos transmitidos por insetos. Agentes causadores de doenças, incluindo vírus e parasitas do Plasmodium que causam malária, se acumulam nas cavidades secretas das células SG. Aqui, eles estão prontos para transmissão para seus hospedeiros vertebrados durante uma refeição sanguínea subsequente. À medida que as glândulas adultas se formam como uma elaboração de restos de brotos de sg larval que persistem além da histolise da SG pupal precoce, a SG larval é um alvo ideal para intervenções que limitam a transmissão da doença. Compreender o desenvolvimento de SG larval pode ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de sua morfologia e adaptações funcionais e auxiliar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão. Este protocolo de vídeo demonstra uma técnica eficiente para isolar, fixar e colorir os GGs larvais dos mosquitos Anopheles gambiae. As glândulas dissecadas de larvas em uma solução de 25% de etanol são fixadas em uma mistura de ácido acético metanol-glacial, seguida por uma lavagem de acetona fria. Depois de algumas enxaguadas em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), as SGs podem ser manchadas com uma ampla gama de corantes marcadores e/ou antisera contra proteínas expressas por SG. Este método para o isolamento de SG larval também poderia ser usado para coletar tecidos para análise de hibridização in situ, outras aplicações transcriômicas e estudos proteômicos.
Introdução
A malária é uma grande ameaça à saúde pública que causa quase 230 milhões de infecções e cerca de 409 mil mortes em 20191. A maioria das mortes está na África subsaariana e são causadas pelo parasita Plasmodium falciparum, cujo vetor de insetos é Anopheles gambiae, o tema desta demonstração de vídeo. Embora os números indiquem uma queda significativa na taxa anual de mortalidade desde a virada do século (>300.000 mortes anuais a menos), as reduções promissoras nas taxas de doença observadas de 2000 a 2015 estão diminuindo, sugerindo a necessidade de novas abordagens para limitar a transmissão da doença2....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Elaboração de soluções e ferramentas
- Elaboração da solução de dissecção
- Para preparar a solução de dissecação, adicione 2,5 mL de 100% de etanol a 7,5 mL de H2O destilado em um tubo plástico de 15. Inverta o tubo 3 vezes para misturar.
NOTA: Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por várias semanas.
- Para preparar a solução de dissecação, adicione 2,5 mL de 100% de etanol a 7,5 mL de H2O destilado em um tubo plástico de 15. Inverta o tubo 3 vezes para misturar.
- Preparação de estoque salino tampão de fosfato de 10x (PBS)
- Para preparar 10x de estoque PBS, adicione 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl e 2 g KCl a 800 mL de água desionizada. Misture com uma barra de mexida ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Glândulas salivares são relativamente fáceis de dissecar de todas as larvas estágio 4. Larvas masculinas e femininas podem ser distinguidas no estágio larval L4 tardio por uma listra vermelha ao longo do tórax dorsal das fêmeas, mas não dos machos(Figura 2). Observamos também que a morfologia antenal é muito mais elaborada no masculino do que nas larvas L4 fêmeas (Figura 2),semelhante às diferenças observadas nesta estrutura em mosquitos adultos. Juntamente com .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir de um protocolo de dissecção Drosophila SG e um protocolo de dissecção de mosquitosadultos 14,15,16. No entanto, a maioria dos marcadores não penetrou na membrana do porão (dados não mostrados) ao utilizar os métodos de dissecção adulta e coloração de SG. As adaptações do protocolo adulto incluíram dissecar as glândulas em uma solução de 25% etoh, lavar as glândulas com uma combina.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Instituto johns Hopkins de pesquisa de malária pelo acesso e criação de larvas an. gambiae.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| Pincel NaCl | Millipore | Sigma S7653 | |
| Acetona | Millipore Sigma | 179124 | |
| com cerdas macias | Conjunto de pincéis de detalhe Amazon (SN NJDF) | B08LH63D89 | |
| lamínulas (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Álcool etílico 200 prova | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipeta | Gilson | P200 | |
| Ácido Acético Glacial | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Pinças de joalheiros, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Metanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Esmalte | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipídio) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Toalhas/lenços umedecidos | ULINE | S-7128 | |
| Placa de Petri (para fazer placa de massa) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pontas de Pipeta | Gilson | Tips E200ST | |
| Pipeta de Transferência de Plástico | Fisher Científico | S304671 | |
| Anticorpos primários (por exemplo, Crb, Rab11) | Estudos de Desenvolvimento Banco de Hiridoma (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) ou Rabbit anti-Rab11 | |
| Anticorpos secundários com etiquetas fluorescentes (por exemplo, Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Resina de silicone e agente de cura para placa de massa | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, fosco em uma extremidade para rotulagem | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Aglutinina de Gérmen de Trigo | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referências
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
