Disseksjon og immunstaining av Larval spyttkjertler fra Anopheles gambiae Mygg
Summary
Den voksne mygg spyttkjertelen (SG) er nødvendig for overføring av alle myggbårne patogener til sine menneskelige verter, inkludert virus og parasitter. Denne videoen demonstrerer effektiv isolasjon av bærekraftsmålene fra larvalstadiet (L4) Anopheles gambiae mygg og forberedelse av L4-bærekraftsmålene for videre analyse.
Abstract
Mygg spyttkjertler (SGs) er et nødvendig gateway organ for overføring av insektbårne patogener. Sykdomsfremkallende midler, inkludert virus og Plasmodium-parasittene som forårsaker malaria, akkumuleres i sekretoriske hulrom av SG-celler. Her er de klar for overføring til vertebratvertene sine under et påfølgende blodmåltid. Ettersom voksne kjertler dannes som en utarbeidelse av larval SG-kanalknopprester som vedvarer utover tidlig pupal SG-histolyse, er larval SG et ideelt mål for intervensjoner som begrenser sykdomsoverføring. Forståelse av larval SG-utvikling kan bidra til å utvikle en bedre forståelse av morfologi og funksjonelle tilpasninger og hjelpe til med å vurdere nye intervensjoner som retter seg mot dette organet. Denne videoprotokollen demonstrerer en effektiv teknikk for å isolere, fikse og farge larval SGs fra Anopheles gambiae mygg. Kjertler dissekert fra larver i en 25% etanoloppløsning er festet i en metanol-issyreblanding, etterfulgt av en kald acetonvask. Etter noen skyllinger i fosfatbufret saltvann (PBS) kan SGs farges med et bredt utvalg av markørfarger og/eller antisera mot SG-uttrykte proteiner. Denne metoden for larval SG-isolasjon kan også brukes til å samle vev for in situ hybridiseringsanalyse, andre transkripsjonsapplikasjoner og proteomiske studier.
Introduction
Malaria er en stor folkehelsetrussel som forårsaker nesten 230 millioner infeksjoner og anslagsvis 409 000 dødsfall i 20191. De fleste dødsfall er i Afrika sør for Sahara og er forårsaket av parasitten Plasmodium falciparum, hvis insektvektor er Anopheles gambiae, emnet for denne videodemonstrasjonen. Selv om tallene indikerer et betydelig fall i årlig dødsrate siden århundreskiftet (> 300.000 færre årlige dødsfall), er den lovende nedgangen i sykdomsraten observert fra 2000 til 2015 avsmalnende, noe som tyder på behovet for nye tilnærminger til å begrense sykdomsoverføring2. Blant lovende tilleggsstrategier for å kontrollere og muligens eliminere malaria er rettet mot myggvektorkapasitet ved hjelp av CRISPR / Cas9-basert genredigering og gen-drive3,4,5. Faktisk er det målrettingen av myggvektoren (gjennom utvidet bruk av langvarige insektmiddelbehandlede sengenett) som har hatt størst innvirkning på å redusere sykdomsoverføring6.
Kvinnelige mygg kjøper Plasmodium gametocytter fra et infisert menneske under et blodmåltid. Etter befruktning, modning, midgut epiteltraversering, befolkningsutvidelse og hemocoelnavigasjon i sine obligatoriske myggverter, invaderer hundrevis til titusenvis av Plasmodium-sporozoitter myggsmulene og fyller sekretoriske hulrom i de bestanddelene sekretoriske celler. Når de er inne i sekretoriske hulrom, har parasittene direkte tilgang til spyttkanalen og er dermed klar for overføring til en ny virveldyrvert ved neste blodmel. Fordi bærekraftsmål er avgjørende for overføring av malariafremkallende sporozoitter til sine menneskelige verter, og laboratoriestudier tyder på at bærekraftsmålene ikke er avgjørende for blodfôring, myggoverlevelse eller fecundity7,8,9, representerer de et ideelt mål for overføringsblokkerende tiltak. Voksen mygg SGs dannes som en utarbeidelse av “duct bud” rester i larval SGs som vedvarer utover tidlig pupal SG histolyse10, noe som gjør larval SG et ideelt mål for intervensjoner for å begrense overføring av sykdom i voksenstadiet.
Karakterisering av larvestadiet av SG-utvikling kan bidra til å utvikle ikke bare en bedre forståelse av morfologi og funksjonelle tilpasninger, men kan også bidra til å vurdere nye intervensjoner som retter seg mot dette organet gjennom genredigering av viktige SG-regulatorer. Fordi alle tidligere studier av larval spyttkjertelarkitektur predate immunostaining og moderne bildeteknikker10,11, har vi utviklet en protokoll for isolering og farging av spyttkjertler med en rekke antistoffer og cellemarkører12. Denne videoen demonstrerer denne tilnærmingen til utvinning, fiksering og farging av larval SGs fra Anopheles gambiae L4 larver for konfikal avbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet heri ble tilpasset fra en Drosophila SG disseksjonsprotokoll og en voksen mygg disseksjonsprotokoll14,15,16. Imidlertid trengte de fleste markører ikke inn i kjellermembranen (data ikke vist) ved bruk av voksen disseksjon og SG-fargingsmetoder. Tilpasninger av voksenprotokollen inkluderte dissekering av kjertlene i en 25% EtOH-løsning, vasking av kjertlene med en kombinasjon av MeOH og issyre, og å ha en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Johns Hopkins Malaria Research Institute for tilgang til og oppdrett av An. gambiae larver.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Referências
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
