Denne undersøgelse beskriver den direkte måling af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel ved hjælp af en stabil isotop glukose tracer via hale vene i både faste og glukose-rige stater i tandem.
Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig sygdom, der resulterer i lidelser i glukosemetabolismen, såsom insulinresistens og glukoseintolerance. Dysreguleret glukosemetabolisme er en vigtig manifestation af sygdommen og er nøglen til dens patogenese. Derfor er undersøgelser, der involverer evaluering af glukosemetabolisme i PCOS, af allerstørste betydning. Meget få undersøgelser har kvantificeret hepatisk glukoseproduktion direkte i PCOS-modeller ved hjælp af ikke-radioaktive glukosesporere. I denne undersøgelse diskuterer vi trinvise instruktioner til kvantificering af satsen for hepatisk glukoseproduktion i en PCOS-musemodel ved at måle M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose, en stabil isotopisk glukose tracer, via gaskromatografi – massespektrometri (GCMS). Denne procedure indebærer oprettelse af stabil isotop glukose tracer opløsning, brug af hale venekateter placering og infusion af glukose tracer i både faste og glukose-rige stater i samme mus i tandem. Berigelsen af [6,6-2H2]glukose måles ved hjælp af pentaacetatderivater i GCMS. Denne teknik kan anvendes på en lang række undersøgelser, der involverer direkte måling af hastigheden af leverglukoseproduktion.
Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig lidelse forekommer hos 12%-20% af reproduktive alderen kvinder1,2. Det er en kompleks sygdom, der resulterer i variable fænotyper, der involverer polycystiske æggestokke, uregelmæssig menstruation og klinisk eller laboratoriebevis for hyperandrogenemi, og er typisk diagnosticeret, når en kvinde opfylder to af de tre kriterier3. Et fremherskende aspekt af PCOS, og en nøglefaktor i sin patogenese, er metaboliske sindsforvirring, der findes hos kvinder, der har sygdommen. Kvinder med PCOS har højere forekomster af insulinresistens, glukoseintolerance, fedme og metabolisk syndrom3,4,5,6. Insulinresistens er ikke kun en manifestation af sygdommen, men det menes at bidrage til sin patogenese ved at forstærke virkningen af luteiniserende hormon i æggestokken og derved føre til øget androgen produktion7,8. Insulinresistens menes at have flere mulige oprindelser, men undersøgelser tyder på, at det kan skyldes unormale mønstre af insulinreceptor signalering9,10. Undersøgelser har evalueret insulinresistens hos PCOS-patienter ved hjælp af guldstandardteknikken hyperinsulinæmisk-euglykæmisk klemme11,12,13,14,15. Kvinder med PCOS, uanset BMI, har højere niveauer af insulinresistens sammenlignet med kontrol. Insulinkontrol over glukoseproduktionen er nedsat i lidelser af insulinresistens, der fører til overskydende glukoseproduktion. For eksempel har diabetikere øget glukoneogenese og nedsat undertrykkelse af glykogenolyse16. Desuden er nedsat undertrykkelse af glukoseproduktionen blevet observeret hos diabetiske rotter17. Selvom klemmeundersøgelser kan give en måling af insulinresistens, fokuserer få undersøgelser i PCOS på direkte måling af glukoseproduktion i faste- og fodrede tilstande. Dette kræver brug af en ikke-radioaktiv isotopisk glukose tracer infusion og måling via massespektrometri.
Dyremodeller er blevet flittigt anvendt i PCOS-forskning. Både lean og fede-type PCOS murine modeller er blevet skabt ved at administrere androgener prænatally, prepubertally, eller post-puberteten18. Gnaver PCOS-modeller viser også metaboliske forskelle sammenlignet med deres respektive kontroller. Tidligere data fra vores laboratorium viste unormale glukosetolerancetest (GTT) i PCOS-musemodeller (lean og fede), i overensstemmelse med human PCOS-litteratur19. Brug af en slank og overvægtig dyremodel giver mulighed for yderligere undersøgelse af metaboliske forskelle. Specifikt tillader denne model evaluering af glukoseproduktionen direkte ved hjælp af isotopiske glukosesporere. En af de mest almindeligt anvendte stabile isotopiske glukose tracer er [6,6-2H2]glukose. Glukoseberigelsen [6,6-2H2] kan måles ved hjælp af et pentaacetatderivater som tidligere beskrevet20.
I denne undersøgelse var vores mål at måle hastigheden af leverglukoseproduktion i faste- og glukoserig tilstand hos PCOS-mus ved hjælp af isotopisk glukoseinfusion. Disse teknikker kan anvendes på en lang række eksperimenter, der involverer glukose kinetiker.
Hyperglykæmi og unormal glukose metabolisme / homøostase er funktioner i PCOS. Blodsukkerniveauet opretholdes ved en kombination af glukose fra kost- og glukoseproduktion via glykogenolyse og glukoneogenese og glykogene under kontrol af hormon og enzymer. Leverglukoseproduktion undertrykkes af tilstedeværelsen af øgede cirkulerende glukoseniveauer. I lidelser af unormal glukose metabolisme, regulering af undertrykkelsen af glukoseproduktionen er kompromitteret fører til hyperglykæmi. Mens mange undersøgel…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af uddannelsesstipendier fra Institut for Obstetrik og Gynækologi, Baylor College of Medicine (ALG) og R-01 forskningstilskud (Tilskud # DK114689) til CSB, SC og JM fra National Institutes of Health.
0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
Caging pellets | |||
Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |