Evaluering av leverglukoseproduksjon i en musmodell av polycystisk eggstokksyndrom

Summary

Denne studien beskriver den direkte målingen av leverglukoseproduksjon i en polycystisk eggstokksyndrommusmodell ved å bruke en stabil isotopisk glukosesporer via haleåre i både faste og glukoserike tilstander i tandem.

Abstract

Polycystisk eggstokk syndrom (PCOS) er en vanlig sykdom som resulterer i forstyrrelser i glukosemetabolismen, som insulinresistens og glukoseintoleranse. Dysregulert glukosemetabolisme er en viktig manifestasjon av sykdommen og er nøkkelen til patogenesen. Derfor er studier som involverer evaluering av glukosemetabolisme i PCOS av største betydning. Svært få studier har kvantifisert leverglukoseproduksjon direkte i PCOS-modeller ved hjelp av ikke-radioaktive glukosesporere. I denne studien diskuterer vi trinnvise instruksjoner for kvantifisering av hastigheten på leverglukoseproduksjon i en PCOS-musemodell ved å måle M+2-berikelse av [6,6-2H2]glukose, en stabil isotopisk glukosesporer, via gasskromatografi – massespektrometri (GCMS). Denne prosedyren innebærer opprettelse av stabil isotopisk glukosesporerløsning, bruk av hale venekateterplassering og infusjon av glukosesporeren i både faste og glukoserike tilstander i samme mus i tandem. Berikelsen av [6,6-2H2]glukose måles ved hjelp av pentaacetatderivat i GCMS. Denne teknikken kan brukes på et bredt spekter av studier som involverer direkte måling av hastigheten på leverglukoseproduksjon.

Introduction

Polycystisk eggstokk syndrom (PCOS) er en vanlig lidelse som forekommer hos 12%-20% av reproduktive ^kvinner1,2. Det er en kompleks sykdom som resulterer i variable fenotyper som involverer polycystiske eggstokkene, uregelmessige mensen og kliniske eller laboratoriebevis for hyperandrogenemi, og diagnostiseres vanligvis når en kvinne oppfyller to av de tre ^kriteriene3. Et dominerende aspekt av PCOS, og en nøkkelfaktor i patogenesen, er metabolske derangementer som finnes hos kvinner som har sykdommen. Kvinner med PCOS har høyere forekomster av insulinresistens, glukoseintoleranse, fedme og metabolsk syndrom3,4,5,6. Insulinresistens er ikke bare en manifestasjon av sykdommen, men det antas å bidra til patogenesen ved å forsterke virkningen av luteiniserende hormon i eggstokken og dermed føre til økt androgenproduksjon7,8. Insulinresistens antas å ha flere mulige opprinnelser, men studier tyder på at det kan skyldes unormale mønstre av insulinreseptorsignalering9,10. Studier har evaluert insulinresistens hos PCOS-pasienter ved hjelp av gullstandardteknikken til hyperinsulinemisk-euglykemisk klemme11,12,13,14,15. Kvinner med PCOS, uavhengig av BMI, har høyere nivåer av insulinresistens sammenlignet med kontroller. Insulinkontroll over glukoseproduksjon er svekket i forstyrrelser av insulinresistens som fører til overflødig glukoseproduksjon. For eksempel har diabetikere økt forekomst av glukoneogenese og nedsatt undertrykkelse av glykogenolyse16. Videre er nedsatt undertrykkelse av glukoseproduksjon observert hos diabetikerrotter17. Selv om klemmestudier kan gi en måling av insulinresistens, er det få studier i PCOS som fokuserer på direkte måling av glukoseproduksjon i faste- og fed-tilstander. Dette krever bruk av en ikke-radioaktiv isotopisk glukosesporerinfusjon og måling via massespektrometri.

Dyremodeller har blitt mye brukt i PCOS-forskning. Både magre og overvektige PCOS murine modeller har blitt opprettet ved å administrere androgener prenatalt, prepubertally, eller post-pubertally18. Gnager PCOS-modeller viser også metabolske forskjeller sammenlignet med deres respektive kontroller. Tidligere data fra laboratoriet vårt viste unormale glukosetoleransetester (GTT) i PCOS-musemodeller (mager og overvektig), i samsvar med menneskelig ^{PCOS-litteratur19}. Bruk av en mager og overvektig dyremodell tillater videre undersøkelse av metabolske forskjeller. Spesielt tillater denne modellen evaluering av hastigheten på glukoseproduksjon direkte ved hjelp av isotopiske glukosesporere. En av de mest brukte stabile isotopiske glukosesporeren er [6,6-2H2]glukose. [6,6-2H2]glukoseberikelse kan måles ved hjelp av et pentaacetatderivat som tidligere ^beskrevet20.

I denne studien var vårt mål å måle frekvensen av leverglukoseproduksjon i faste og glukoserik tilstand hos PCOS-mus ved hjelp av isotopisk glukoseinfusjon. Disse teknikkene kan brukes på et bredt spekter av eksperimenter som involverer glukosekinetikk.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Baylor College of Medicine. 1. Tilberedning av [6,6-2H2]glukose En dag før prosedyren, lag den stabile isotopglukosesporeren i normal saltvann. For dette eksperimentet ble [6,6-2H2]glukose brukt som sporstoff for å måle plasmaglukoseutseende.MERK: I dette eksperimentet ble glukoseproduksjon under faste og glukoserike forhold m…

Representative Results

Ved hjelp av tidligere beskrevne isotopfortynningsligninger ble den totale plasmaglukosehastigheten (glukoseRa) beregnet fra M+2 berikelse av [6,6-2H2]glukose i faste og glukoserike forhold ved hjelp av pentaacetatderivatet21. Under steady-state forhold antas det at utseendet av glukose er lik hastigheten på forsvinning av glukose. I kontrollgruppen var den totale glukoseRa 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) etter 6 timers faste og 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) un…

Discussion

Hyperglykemi og unormal glukosemetabolisme / homeostase er funksjoner i PCOS. Blodsukkernivået opprettholdes av en kombinasjon av glukose fra kosthold og glukoseproduksjon via glykogenolyse og glukonogenese og glykogenese, under kontroll av hormon og enzymer. Leverglukoseproduksjon undertrykkes av tilstedeværelsen av økte sirkulerende glukosenivåer. Ved forstyrrelser i unormal glukosemetabolisme er regulering av undertrykkelse av glukoseproduksjon kompromittert, noe som fører til hyperglykemi. Mens mange st…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion