Оценка производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников

Summary

Это исследование описывает прямое измерение производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников с использованием стабильного изотопного индикатора глюкозы через хвостовую вену как натощак, так и в богатых глюкозой состояниях в тандеме.

Abstract

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным заболеванием, которое приводит к нарушениям метаболизма глюкозы, таким как резистентность к инсулину и непереносимость глюкозы. Дисрегулируемый метаболизм глюкозы является важным проявлением заболевания и является залогом его патогенеза. Поэтому исследования, включающие оценку метаболизма глюкозы при СПКЯ, имеют первостепенное значение. Очень немногие исследования количественно оценивали производство глюкозы в печени непосредственно в моделях СПКЯ с использованием нерадиоактивных индикаторов глюкозы. В этом исследовании мы обсудим пошаговые инструкции по количественной оценке скорости производства глюкозы в печени в мышиной модели СПКЯ путем измерения обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозы, стабильного изотопного индикатора глюкозы, с помощью газовой хроматографии – масс-спектрометрии (GCMS). Эта процедура включает в себя создание стабильного изотопного раствора индикатора глюкозы, использование катетера хвостовой вены и инфузию индикатора глюкозы как в состоянии натощак, так и в состояниях, богатых глюкозой, у одной и той же мыши в тандеме. Обогащение [6,6-2H2]глюкозы измеряют с использованием производного пентаацетата в GCMS. Этот метод может быть применен к широкому спектру исследований, включающих прямое измерение скорости производства глюкозы в печени.

Introduction

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным расстройством, встречающимся у 12%-20% женщин репродуктивного ^{возраста1,2}. Это сложное заболевание, приводящее к переменным фенотипам, включающим поликистоз яичников, нерегулярные менструации и клинические или лабораторные доказательства гиперандрогении, и обычно диагностируется, когда женщина соответствует двум из трех ^{критериев3}. Преобладающим аспектом СПКЯ и ключевым фактором его патогенеза являются метаболические нарушения, которые обнаруживаются у женщин, страдающих этим заболеванием. Женщины с СПКЯ имеют более высокие показатели резистентности к инсулину, непереносимости глюкозы, ожирения и метаболического ^{синдрома3,4,5,6}. Инсулинорезистентность является не только проявлением заболевания, но и, как полагают, способствует его патогенезу, потенцируя действие лютеинизирующего гормона в яичнике, что приводит к увеличению выработки ^{андрогенов7,8}. Считается, что резистентность к инсулину имеет несколько возможных истоков, но исследования показывают, что это может быть связано с аномальными паттернами передачи сигналов рецепторов ^{инсулина9,10}. Исследования оценивали резистентность к инсулину у пациентов с СПКЯ с использованием метода золотого стандарта гиперинсулинемико-эугликемического зажима11,12,13,14,15. Женщины с СПКЯ, независимо от ИМТ, имеют более высокие уровни резистентности к инсулину по сравнению с контрольной группой. Инсулиновый контроль над выработкой глюкозы нарушается при нарушениях инсулинорезистентности, приводящих к избыточной выработке глюкозы. Например, у больных сахарным диабетом повышены показатели глюконеогенеза и нарушено подавление гликогенолиза16. Кроме того, нарушение подавления выработки глюкозы наблюдалось у крыс с ^{диабетом17}. Хотя исследования зажима могут дать измерение резистентности к инсулину, немногие исследования при СПКЯ сосредоточены на прямом измерении производства глюкозы в состоянии голодания и кормления. Это требует использования нерадиоактивного изотопного индикатора глюкозы и инфузии и измерения с помощью масс-спектрометрии.

Животные модели широко используются в исследованиях СПКЯ. Как худые, так и тучные модели СПКЯ были созданы путем введения андрогенов пренатально, препубертально или ^{постпубертально18}. Модели Грызунов СПКЯ также демонстрируют метаболические различия по сравнению с их соответствующими контрольными группами. Предыдущие данные из нашей лаборатории продемонстрировали аномальные тесты на толерантность к глюкозе (ГТТ) в моделях мышей с СПКЯ (худые и тучные), что согласуется с литературой по СПКЯ ^{человека19}. Использование модели бережливого и тучного животного позволяет дополнительно исследовать метаболические различия. В частности, эта модель позволяет оценить скорость производства глюкозы непосредственно с использованием изотопных индикаторов глюкозы. Одним из наиболее часто используемых стабильных изотопных индикаторов глюкозы является [6,6-2H2]глюкоза. Обогащение [6,6-2H2] глюкозой может быть измерено с использованием производного пентаацетата, как описано ^ранее20.

В этом исследовании наша цель состояла в том, чтобы измерить скорость производства глюкозы в печени при голодании и богатом глюкозой состоянии у мышей с СПКЯ с использованием изотопной инфузии глюкозы. Эти методы могут быть применены к широкому спектру экспериментов, связанных с кинетикой глюкозы.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского колледжа Бейлора. 1. Получение [6,6-2H2] глюкозы За день до процедуры приготовьте индикатор стабильного изотопа глюкоз?…

Representative Results

Используя ранее описанные уравнения разбавления изотопов, общая скорость глюкозы в плазме (глюкозаRa) была рассчитана из обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозой в условиях голодания и богатых глюкозой состояний с использованием производного пентаацетата21. В стацион?…

Discussion

Гипергликемия и аномальный метаболизм глюкозы / гомеостаз являются особенностями СПКЯ. Уровень глюкозы в крови поддерживается комбинацией глюкозы из рациона и производства глюкозы посредством гликогенолиза и глюконеогенеза и гликогенеза под контролем гормонов и ферментов. Про?…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion