Denna studie beskriver direkt mätning av lever glukos produktion i en polycystiskt äggstock syndrom mus modell genom att använda en stabil isotopisk glukos tracer via svans ven i både fasta och glukos-rika stater i tandem.
Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som resulterar i störningar i glukosmetabolismen, såsom insulinresistens och glukosintolerans. Dysreglerad glukosmetabolism är en viktig manifestation av sjukdomen och är nyckeln till dess patogenes. Därför är studier som involverar utvärdering av glukosmetabolism i PCOS av yttersta vikt. Mycket få studier har kvantifierat lever glukosproduktion direkt i PCOS-modeller med icke-radioaktiva glukosspårare. I denna studie diskuterar vi steg-för-steg instruktioner för kvantifiering av graden av lever glukos produktion i en PCOS musmodell genom att mäta M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos, en stabil isotopisk glukos tracer, via gas kromatografi – masspektrometri (GCMS). Denna procedur innebär skapandet av stabil isotopisk glukosspårare lösning, användning av svansveter kateter placering och infusion av glukosspåraren i både fasta och glukosrika tillstånd i samma mus i tandem. Berikningen av [6,6-2H2]glukos mäts med pentaacetatderivat i GCMS. Denna teknik kan tillämpas på en mängd olika studier som involverar direkt mätning av graden av lever glukosproduktion.
Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som förekommer hos 12-20% av reproduktiva kvinnor1,2. det är en komplex sjukdom som resulterar i varierande fenotyper som omfattar polycystiska äggstockar, oregelbundna menstruationer och kliniska eller laboratorium bevis på hyperandrogenemia, och diagnostiseras vanligtvis när en kvinna uppfyller två av de tre kriterierna3. En dominerande aspekt av PCOS, och en nyckelfaktor i dess patogenes, är metaboliska derangements som finns hos kvinnor som har sjukdomen. Kvinnor med PCOS har högre förekomster av insulinresistens, glukosintolerans, fetma och metaboliskt syndrom3,4,5,6. Insulinresistens är inte bara en manifestation av sjukdomen, men det tros bidra till dess patogenes genom att förstärka verkan av luteiniserande hormon i äggstocken och därmed leda till ökad androgenproduktion7,8. Insulinresistens tros ha flera möjliga ursprung men studier tyder på att det kan bero på onormala mönster av insulinreceptorsignalering9,10. Studier har utvärderat insulinresistens hos PCOS-patienter med hjälp av guldstandardtekniken hyperinsulinisk-euglykemisk klämma11,12,13,14,15. Kvinnor med PCOS, oavsett BMI, har högre nivåer av insulinresistens jämfört med kontroller. Insulinkontrollen över glukosproduktionen är nedsatt vid störningar i insulinresistens som leder till överdriven glukosproduktion. Till exempel har diabetiker patienter ökad frekvens av glukoneogenes och nedsatt undertryckande av glykogenolys16. Dessutom har nedsatt undertryckande av glukosproduktionen observerats hos diabetiker råttor17. Även om klämstudier kan ge en mätning av insulinresistens, fokuserar få studier i PCOS på direkt mätning av glukosproduktion i fasta och matade tillstånd. Detta kräver användning av en icke-radioaktiv isotopisk glukosspårare infusion och mätning via masspektrometri.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning i PCOS-forskning. Både mager och överviktig PCOS murine modeller har skapats genom att administrera androgener prenatally, prepubertally, eller post-pubertally18. Gnagare PCOS-modeller visar också metaboliska skillnader jämfört med deras respektive kontroller. Tidigare data från vårt labb visat onormal glukos tolerans tester (GTT) i PCOS mus modeller (mager och överviktig), överensstämmer med mänskliga PCOS litteratur19. Användning av en mager och överviktig djurmodell möjliggör ytterligare undersökning av metaboliska skillnader. Specifikt tillåter denna modell utvärdering av glukosproduktionens hastighet direkt med isotopiska glukosspårare. En av de vanligaste stabila isotopiska glukosspåraren är [6,6-2H2]glukos. [6,6-2H2]glukosberikning kan mätas med hjälp av ett pentaacetatderivat som tidigare beskrivits20.
I denna studie var vårt mål att mäta hastigheten på lever glukosproduktion i fasta och glukos-rikt tillstånd i PCOS möss med hjälp av isotopisk glukos infusion. Dessa tekniker kan tillämpas på ett brett spektrum av experiment som involverar glukoskinetik.
Hyperglykemi och onormal glukosmetabolism/homeostas är funktioner i PCOS. Blodsockernivån upprätthålls av en kombination av glukos från kost- och glukosproduktion via glykogenolys och glukoneogenes och glykogenes, under kontroll av hormon och enzymer. Lever glukosproduktion undertrycks av närvaron av ökade cirkulerande glukosnivåer. Vid störningar av onormal glukosmetabolism äventyras regleringen av undertryckandet av glukosproduktionen vilket leder till hyperglykemi. Medan många studier har visat ind…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av utbildningsbidrag från institutionen för obstetrik och gynekologi, Baylor College of Medicine (ALG) och R-01 forskningsanslag (Anslag # DK114689) för CSB, SC och JM från National Institutes of Health.
0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
Caging pellets | |||
Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |