Utvärdering av leverglukosproduktion i en polycystisk äggstockssyndrom musmodell

Summary

Denna studie beskriver direkt mätning av lever glukos produktion i en polycystiskt äggstock syndrom mus modell genom att använda en stabil isotopisk glukos tracer via svans ven i både fasta och glukos-rika stater i tandem.

Abstract

Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som resulterar i störningar i glukosmetabolismen, såsom insulinresistens och glukosintolerans. Dysreglerad glukosmetabolism är en viktig manifestation av sjukdomen och är nyckeln till dess patogenes. Därför är studier som involverar utvärdering av glukosmetabolism i PCOS av yttersta vikt. Mycket få studier har kvantifierat lever glukosproduktion direkt i PCOS-modeller med icke-radioaktiva glukosspårare. I denna studie diskuterar vi steg-för-steg instruktioner för kvantifiering av graden av lever glukos produktion i en PCOS musmodell genom att mäta M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos, en stabil isotopisk glukos tracer, via gas kromatografi – masspektrometri (GCMS). Denna procedur innebär skapandet av stabil isotopisk glukosspårare lösning, användning av svansveter kateter placering och infusion av glukosspåraren i både fasta och glukosrika tillstånd i samma mus i tandem. Berikningen av [6,6-2H2]glukos mäts med pentaacetatderivat i GCMS. Denna teknik kan tillämpas på en mängd olika studier som involverar direkt mätning av graden av lever glukosproduktion.

Introduction

Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS) är en vanlig sjukdom som förekommer hos 12-20% av reproduktiva ^kvinnor1,2. det är en komplex sjukdom som resulterar i varierande fenotyper som omfattar polycystiska äggstockar, oregelbundna menstruationer och kliniska eller laboratorium bevis på hyperandrogenemia, och diagnostiseras vanligtvis när en kvinna uppfyller två av de tre ^kriterierna3. En dominerande aspekt av PCOS, och en nyckelfaktor i dess patogenes, är metaboliska derangements som finns hos kvinnor som har sjukdomen. Kvinnor med PCOS har högre förekomster av insulinresistens, glukosintolerans, fetma och metaboliskt syndrom3,4,5,6. Insulinresistens är inte bara en manifestation av sjukdomen, men det tros bidra till dess patogenes genom att förstärka verkan av luteiniserande hormon i äggstocken och därmed leda till ökad ^{androgenproduktion7,8}. Insulinresistens tros ha flera möjliga ursprung men studier tyder på att det kan bero på onormala mönster av insulinreceptorsignalering9,10. Studier har utvärderat insulinresistens hos PCOS-patienter med hjälp av guldstandardtekniken hyperinsulinisk-euglykemisk klämma11,12,13,14,15. Kvinnor med PCOS, oavsett BMI, har högre nivåer av insulinresistens jämfört med kontroller. Insulinkontrollen över glukosproduktionen är nedsatt vid störningar i insulinresistens som leder till överdriven glukosproduktion. Till exempel har diabetiker patienter ökad frekvens av glukoneogenes och nedsatt undertryckande av glykogenolys16. Dessutom har nedsatt undertryckande av glukosproduktionen observerats hos diabetiker ^råttor17. Även om klämstudier kan ge en mätning av insulinresistens, fokuserar få studier i PCOS på direkt mätning av glukosproduktion i fasta och matade tillstånd. Detta kräver användning av en icke-radioaktiv isotopisk glukosspårare infusion och mätning via masspektrometri.

Djurmodeller har använts i stor utsträckning i PCOS-forskning. Både mager och överviktig PCOS murine modeller har skapats genom att administrera androgener prenatally, prepubertally, eller ^{post-pubertally18}. Gnagare PCOS-modeller visar också metaboliska skillnader jämfört med deras respektive kontroller. Tidigare data från vårt labb visat onormal glukos tolerans tester (GTT) i PCOS mus modeller (mager och överviktig), överensstämmer med mänskliga PCOS ^litteratur19. Användning av en mager och överviktig djurmodell möjliggör ytterligare undersökning av metaboliska skillnader. Specifikt tillåter denna modell utvärdering av glukosproduktionens hastighet direkt med isotopiska glukosspårare. En av de vanligaste stabila isotopiska glukosspåraren är [6,6-2H2]glukos. [6,6-2H2]glukosberikning kan mätas med hjälp av ett pentaacetatderivat som tidigare ^beskrivits20.

I denna studie var vårt mål att mäta hastigheten på lever glukosproduktion i fasta och glukos-rikt tillstånd i PCOS möss med hjälp av isotopisk glukos infusion. Dessa tekniker kan tillämpas på ett brett spektrum av experiment som involverar glukoskinetik.

Protocol

Alla djurprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Baylor College of Medicine. 1. Beredning av [6,6-2H2]glukos En dag före proceduren, förbered den stabila isotop glukosspåraren i normal saltlösning. För detta experiment användes [6,6-2H2]glukos som en spårämne för att mäta plasma glukos utseende.OBS: I detta experiment mättes glukosproduktion under fasta och glukosrika …

Representative Results

Med hjälp av tidigare beskrivna isotop utspädningsekvationer beräknades den totala plasma glukoshastigheten (glukosRa) från M +2 berikning av [6,6-2H2]glukos i fasta och glukos-rika villkor med hjälp av pentaacetate derivat21. Under steady-state förhållanden antas det att glukosens utseende är lika med graden av försvinnande av glukos. I kontrollgruppen var den totala glukosRa 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 h fasta och 25,80 ± 1,76 mg/(kg·…

Discussion

Hyperglykemi och onormal glukosmetabolism/homeostas är funktioner i PCOS. Blodsockernivån upprätthålls av en kombination av glukos från kost- och glukosproduktion via glykogenolys och glukoneogenes och glykogenes, under kontroll av hormon och enzymer. Lever glukosproduktion undertrycks av närvaron av ökade cirkulerande glukosnivåer. Vid störningar av onormal glukosmetabolism äventyras regleringen av undertryckandet av glukosproduktionen vilket leder till hyperglykemi. Medan många studier har visat ind…

Materials

0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion