Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.
Abstract
Die Mücken-Gen-Editierung ist in mehreren Labors zur Routine geworden, wobei Systeme wie transkriptionsaktivatorähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zinkfingernukleasen (ZFNs) und Homing-Endonukleasen (HEs) etabliert wurden. In jüngster Zeit hat die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) eine einfachere und kostengünstigere Alternative für das Precision Genome Engineering angeboten. Nach der Nuklease-Aktion fixieren DNA-Reparaturwege die gebrochenen DNA-Enden und führen oft Indel ein. Diese Out-of-Frame-Mutationen werden dann verwendet, um die Genfunktion in den Zielorganismen zu verstehen. Ein Nachteil ist jedoch, dass mutierte Individuen keinen dominanten Marker tragen, was die Identifizierung und Verfolgung von mutierten Allelen schwierig macht, insbesondere in Skalen, die für viele Experimente benötigt werden.
Die hochauflösende Schmelzeanalyse (HRMA) ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Variationen in Nukleinsäuresequenzen und verwendet PCR-Schmelzkurven, um solche Variationen nachzuweisen. Diese Post-PCR-Analysemethode verwendet fluoreszierende doppelsträngige DNA-bindende Farbstoffe mit Instrumenten, die über eine Datenerfassungsfunktion zur Temperaturrampenregelung verfügen und leicht auf 96-Well-Plattenformate skaliert werden können. Beschrieben wird hier ein einfacher Workflow mit HRMA zum schnellen Nachweis von CRISPR/Cas9-induzierten Indeln und der Etablierung von Mutantenlinien in der Mücke Ae. aegypti. Entscheidend ist, dass alle Schritte mit einer kleinen Menge Anleggewebe durchgeführt werden können und keine Opferung des Organismus erfordern, so dass genetische Kreuzungen oder Phänotypisierungsassays nach der Genotypisierung durchgeführt werden können.
Introduction
Als Vektoren von Krankheitserregern wie Dengue1-, Zika2– und Chikungunya3-Viren sowie Malariaparasiten4 stellen Moskitos eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit des Menschen dar. Bei all diesen Erkrankungen liegt ein wesentlicher Schwerpunkt der Übertragungsintervention auf der Bekämpfung von Mückenvektoren. Die Untersuchung der Gene, die beispielsweise für die Permissivität gegenüber Krankheitserregern, die Fitness von Mücken, das Überleben, die Fortpflanzung und die Resistenz gegen Insektizide wichtig sind, ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Strategien zur Bekämpfung von Mücken. Für solche Zwecke wird die Genom-Editierung bei Moskitos zu einer gängigen Praxis, insbesondere mit der Entwicklung von Technologien wie HEs, ZFNs, TALENs und zuletzt CRISPR mit Cas9. Die Etablierung von geneditierten Stämmen beinhaltet typischerweise die Rückkreuzung von Individuen, die die gewünschten Mutationen für einige Generationen tragen, um Off-Target- und Gründer- (Engpass-) Effekte zu minimieren, gefolgt von der Kreuzung heterozygoter Individuen, um homozygote oder trans-heterozygote Linien zu erzeugen. In Ermangelung eines dominanten Markers ist in diesem Prozess eine molekulare Genotypisierung notwendig, da in vielen Fällen keine eindeutigen phänotypischen Merkmale für heterozygote Mutanten nachgewiesen werden können.
Obwohl die Sequenzierung der Goldstandard für die genotypische Charakterisierung ist, stellt die Durchführung bei Hunderten oder möglicherweise Tausenden von Individuen erhebliche Kosten, Arbeit und Zeit dar, die erforderlich sind, um Ergebnisse zu erzielen, was besonders für Organismen mit kurzer Lebensdauer wie Moskitos von entscheidender Bedeutung ist. Häufig verwendete Alternativen sind Surveyor Nuclease Assay5 (SNA), T7E1 Assay6 und High Resolution Melt Analysis (HRMA, überprüft in7). Sowohl SNA als auch T7E1 verwenden Endonukleasen, die nur nicht übereinstimmende Basen spalten. Wenn eine mutierte Region des heterozygoten mutanten Genoms amplifiziert wird, werden DNA-Fragmente von mutierten und Wildtyp-Allelen geglüht, um eine nicht übereinstimmende doppelsträngige DNA (dsDNA) herzustellen. SNA erkennt das Vorhandensein von Mismatches über die Verdauung mit einer Mismatch-spezifischen Endonuklease und einer einfachen Agarosegelelektrophorese. Alternativ nutzt HRMA die thermodynamischen Eigenschaften von dsDNA, die durch dsDNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden, wobei die Dissoziationstemperatur des Farbstoffs je nach Vorhandensein und Art der Mutation variiert. HRMA wurde unter anderem für den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs)8, die mutierte Genotypisierung von Zebrafischen9, mikrobiologische Anwendungen10 und pflanzengenetische Forschung11 eingesetzt.
Dieser Artikel beschreibt HRMA, eine einfache Methode der molekularen Genotypisierung für mutierte Moskitos, die durch die CRISPR / Cas9-Technologie erzeugt werden. Zu den Vorteilen von HRMA gegenüber alternativen Techniken gehören 1) Flexibilität, da sie sich für verschiedene Gene als nützlich erwiesen hat, eine breite Palette von Indelgrößen sowie die Unterscheidung zwischen verschiedenen Indelgrößen und heterozygoter, homozygoter und trans-heterozygoter Differenzierung12,13,14, 2) Kosten, da sie auf häufig verwendeten PCR-Reagenzien basiert, und 3) Zeitersparnis, da es in nur wenigen Stunden durchgeführt werden kann. Darüber hinaus verwendet das Protokoll einen kleinen Körperteil (ein Bein) als DNA-Quelle, so dass die Mücke den Genotypisierungsprozess überleben kann, was die Etablierung und Aufrechterhaltung von Mutantenlinien ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hochauflösende Schmelzeanalyse bietet eine einfache und schnelle Lösung für die Identifizierung von Indeln, die durch die CRISPR/Cas9-Technologie in der Vektormücke Ae. aegypti erzeugt werden. Es bietet Flexibilität und ermöglicht die Genotypisierung von Mücken, die für eine Vielzahl von Genen mutiert sind, vom Flugmuskel bis zum Eisenstoffwechsel und mehr13,14. HRMA kann in nur wenigen Stunden von der Probenentnahme bis zur endgültigen Anal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle Figuren wurden mit Biorender.com unter einer Lizenz der Texas A&M University erstellt. Diese Arbeit wurde durch Mittel des National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 und AI115138 bis Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research im Rahmen des Insect Vectored Disease Grant Program und des USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1018401 unterstützt.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
Referências
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