זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש
Summary
מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.
Abstract
עריכת גנים יתושים הפכה לשגרה במספר מעבדות עם הקמת מערכות כגון גרעיני אפקט דמוי מפעיל תמלול (TALENs), גרעינים אצבע אבץ (ZFNs), ו אנדונקולאזים ביות (HEs). לאחרונה, טכנולוגיית החלבון 9 (Cas9) הקשורה באופן קבוע לסירוגין משולבת באופן קבוע (CRISPR)/CRISPR מציעה חלופה קלה וזולה יותר להנדסת גנום מדויקת. בעקבות פעולת נוקלאז, נתיבי תיקון DNA יתקנו את קצות ה- DNA השבורים, ולעתים קרובות יציגו indels. מוטציות מחוץ למסגרת אלה משמשות להבנת תפקוד הגנים באורגניזמי היעד. החיסרון, עם זאת, הוא כי אנשים מוטנטיים לשאת שום סמן דומיננטי, מה שהופך זיהוי ומעקב של אללים מוטנטיים מאתגרים, במיוחד בקנה מידה הדרוש לניסויים רבים.
ניתוח המסה ברזולוציה גבוהה (HRMA) היא שיטה פשוטה לזיהוי וריאציות ברצפי חומצות גרעין ומשתמשת בעקומות התכה של PCR כדי לזהות וריאציות כאלה. שיטת ניתוח זו לאחר PCR משתמשת בצבעי כריכת DNA כפולים נטושים פלואורסצנטיים עם מכשור בעל יכולת לכידת נתונים של בקרת טמפרטורה והוא מוגדל בקלות לפורמטים של לוחות של 96 באר. מתואר כאן הוא זרימת עבודה פשוטה באמצעות HRMA לגילוי מהיר של INDELs המושרה CRISPR / Cas9 והקמת קווים מוטנטיים יתוש Ae. aegypti. באופן קריטי, כל השלבים יכולים להתבצע עם כמות קטנה של רקמת רגל ואינם דורשים הקרבת האורגניזם, המאפשר צלבים גנטיים או בדיקות פנוטיפינג להתבצע לאחר genotyping.
Introduction
כמו וקטורים של פתוגנים כגון דנגי1, זיקה2, ו chikungunya3 וירוסים, כמו גם טפילים מלריה4, יתושים מהווים איום משמעותי על בריאות הציבור על בני אדם. עבור כל המחלות האלה, יש מיקוד משמעותי של התערבות שידור על השליטה של וקטורים יתושים. חקר הגנים החשובים, למשל, מתירניות לפתוגנים, כושר יתושים, הישרדות, רבייה ועמידות לחומרי הדברה הוא המפתח לפיתוח אסטרטגיות חדשות לבקרת יתושים. למטרות כאלה, עריכת גנום יתושים הופכת למנהג נפוץ, במיוחד עם פיתוח טכנולוגיות כגון HEs, ZFNs, TALENs, ולאחרונה, CRISPR עם Cas9. הקמת זנים בעריכת גנים כרוכה בדרך כלל באנשים הנושאים את המוטציות הרצויות במשך כמה דורות כדי למזער את ההשפעות מחוץ למטרה ומייסד (צוואר בקבוק), ואחריו לחצות אנשים הטרוזיגוס כדי ליצור קווי הומוזיגוס או טרנס-הטרוזיגוס. בהיעדר סמן דומיננטי, genotyping מולקולרי הוא הכרחי בתהליך זה, כי במקרים רבים, אין תכונות פנוטיפיות ברורות ניתן לזהות עבור מוטציות heterozygous.
למרות רצף הוא תקן הזהב לאפיון גנוטיפי, ביצוע זה על פני מאות, או אולי אלפי אנשים, מהווה עלויות משמעותיות, עבודה, וזמן הנדרש כדי להשיג תוצאות, וזה קריטי במיוחד עבור אורגניזמים עם תוחלת חיים קצרה כגון יתושים. חלופות נפוצות הן Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 וניתוח נמס ברזולוציה גבוהה (HRMA, שנסקר ב7). הן SNA והן T7E1 משתמשות באידונוקלאזים המבקעים רק בסיסים לא תואמים. כאשר מוגבר אזור מוטציה של הגנום המוטנטי ההטרוזיגוסיגוס, רסיסי DNA מאללים מוטנטיים ופראיים מחושלים כדי ליצור דנ”א דו-גדילי לא תואם (dsDNA). SNA מזהה את הנוכחות של אי התאמות באמצעות עיכול עם אנדונוקלאז ספציפי לאי התאמה ואלקטרופורזה ג’ל אגרוז פשוט. לחלופין, HRMA משתמש בתכונות התרמודינמיות של dsDNA שזוהו על ידי צבעים פלואורסצנטיים מחייבים DSDNA, עם טמפרטורת הניתוק של הצבע המשתנה בהתבסס על נוכחות וסוג המוטציה. HRMA שימש לגילוי פולימורפיזם חד-נוקלאוטיד (SNPs)8, גנוטיפינג מוטנטי של דגי זברה9, יישומים מיקרוביולוגיים10, ומחקר גנטי צמח11, בין היתר.
מאמר זה מתאר HRMA, שיטה פשוטה של genotyping מולקולרי עבור יתושים מוטנטיים שנוצר על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9. היתרונות של HRMA על פני טכניקות חלופיות כוללים 1) גמישות, כפי שהוא הוכח שימושי עבור גנים שונים, מגוון רחב של גדלים indel, כמו גם את ההבחנה בין גדלים indel שונים heterozygous, הומוזיגוס, ו trans-heterozygous בידול12,13,14, 2) עלות, כפי שהוא מבוסס על ריאגנטים PCR נפוץ, ו 3) חיסכון בזמן, כפי שהוא יכול להתבצע רק כמה שעות. בנוסף, הפרוטוקול משתמש בחלק גוף קטן (רגל) כמקור לדנ”א, ומאפשר ליתושים לשרוד את תהליך הגנוטיפינג, ומאפשר הקמה ותחזוקה של קווים מוטנטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה מציע פתרון פשוט ומהיר לזיהוי של indels שנוצר על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 יתוש וקטור Ae. aegypti. הוא מספק גמישות, ומאפשר גנוטיפינג של יתושים שעברו מוטציה למגוון רחב של גנים משריר הטיסה ועד חילוף החומרים של הברזל ועוד 13,14. HRMA יכול להתבצע ר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל הדמויות נוצרו עם Biorender.com תחת רישיון לאוניברסיטת טקסס A&M. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI137112 ו- AI115138 ל- Z.N.A.), מחקר טקסס A&M AgriLife במסגרת תוכנית המענקים למחלות וקטוריות חרקים, והמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי, פרויקט האץ ‘ 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
Referências
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
