Обнаружение Indel после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава высокого разрешения у комаров Aedes aegypti
Summary
В этой статье подробно описывается протокол быстрой идентификации инделов, индуцированных CRISPR/Cas9, и выбора мутантных линий у комара Aedes aegypti с использованием анализа расплава с высоким разрешением.
Abstract
Редактирование генов комаров стало обычным делом в нескольких лабораториях с созданием таких систем, как транскрипционно-активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs), нуклеазы цинкового пальца (ZFNs) и самонаводящиеся эндонуклеазы (HEs). Совсем недавно технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) предложила более простую и дешевую альтернативу для точной геномной инженерии. После действия нуклеазы пути репарации ДНК будут исправлять сломанные концы ДНК, часто вводя индели. Эти внекадровые мутации затем используются для понимания функции генов в целевых организмах. Недостатком, однако, является то, что мутантные особи не несут доминирующего маркера, что затрудняет идентификацию и отслеживание аллелей мутантов, особенно в масштабах, необходимых для многих экспериментов.
Анализ расплава с высоким разрешением (HRMA) является простым методом выявления вариаций последовательностей нуклеиновых кислот и использует кривые плавления ПЦР для обнаружения таких изменений. Этот метод анализа после ПЦР использует флуоресцентные двухцепочечные ДНК-связывающие красители с приборами, которые имеют возможность сбора данных о контроле температуры и легко масштабируются до форматов пластин с 96 лунками. Здесь описан простой рабочий процесс с использованием HRMA для быстрого обнаружения CRISPR/Cas9-индуцированных инделей и установления мутантных линий у комара Ae. aegypti. Критически важно, что все этапы могут быть выполнены с небольшим количеством ткани ноги и не требуют жертвоприношения организма, позволяя проводить генетические скрещивания или фенотипирование после генотипирования.
Introduction
Как переносчики патогенов, таких как вирусы денге1, Зика2 и чикунгунья3, а также малярийные паразиты4, комары представляют значительную угрозу для здоровья людей. В связи со всеми этими заболеваниями основное внимание уделяется мерам по борьбе с комарами-переносчиками. Изучение генов, важных, например, в отношении вседозволенности к патогенам, приспособленности комаров, выживания, размножения и устойчивости к инсектицидам, является ключом к разработке новых стратегий борьбы с комарами. Для таких целей редактирование генома у комаров становится обычной практикой, особенно с развитием таких технологий, как HEs, ZFN, TALENs и совсем недавно CRISPR с Cas9. Создание генетически отредактированных штаммов обычно включает в себя обратное скрещивание людей, несущих желаемые мутации в течение нескольких поколений, чтобы свести к минимуму нецелевые и фаундокторные (узкие места) эффекты, с последующим скрещиванием гетерозиготных особей для генерации гомозиготных или трансгетерозиготных линий. В отсутствие доминирующего маркера молекулярное генотипирование необходимо в этом процессе, поскольку во многих случаях у гетерозиготных мутантов не может быть обнаружено четких фенотипических признаков.
Хотя секвенирование является золотым стандартом для генотипической характеристики, выполнение этого для сотен или, возможно, тысяч особей сопряжено со значительными затратами, трудом и временем, необходимыми для получения результатов, что особенно важно для организмов с короткой продолжительностью жизни, таких как комары. Обычно используемыми альтернативами являются Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 и анализ расплава с высоким разрешением (HRMA, рассмотрено в 7). И SNA, и T7E1 используют эндонуклеазы, которые расщепляют только несоответствующие основания. Когда мутированная область гетерозиготного мутантного генома амплифицируется, фрагменты ДНК из аллелей мутантного и дикого типа отжигаются, чтобы сделать несоответствующую двухцепочечную ДНК (dsDNA). СНС обнаруживает наличие несоответствий через пищеварение с несоответствующей специфической эндонуклеазой и простым электрофорезом агарозного геля. В качестве альтернативы HRMA использует термодинамические свойства dsDNA, обнаруженные флуоресцентными красителями, связывающими dsDNA, при этом температура диссоциации красителя изменяется в зависимости от наличия и типа мутации. HRMA использовался для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)8, мутантного генотипирования рыб данио9, микробиологических приложений10 и генетических исследований растений11.
В этой статье описывается HRMA, простой метод молекулярного генотипирования для комаров-мутантов, генерируемый технологией CRISPR / Cas9. Преимущества HRMA перед альтернативными методами включают в себя 1) гибкость, поскольку она доказала свою полезность для различных генов, широкий диапазон размеров инделя, а также различие между различными размерами инделя и гетерозиготной, гомозиготной и трансгетерозиговой дифференцировкой12,13,14, 2) стоимость, поскольку она основана на широко используемых реагентах ПЦР, и 3) экономию времени, так как это может быть выполнено всего за несколько часов. Кроме того, протокол использует небольшую часть тела (ногу) в качестве источника ДНК, что позволяет комару выжить в процессе генотипирования, позволяя устанавливать и поддерживать мутантные линии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ расплава с высоким разрешением предлагает простое и быстрое решение для идентификации инделей, генерируемых технологией CRISPR/Cas9 в комаре-переносчике Ae. aegypti. Он обеспечивает гибкость, позволяя генотипировать комаров, мутировавших для широкого спектра генов от мышц полета д?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все фигуры были созданы с Biorender.com по лицензии Техасского университета A&M. Эта работа была поддержана средствами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (AI137112 и AI115138 до Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research в рамках Программы грантов на переносчики насекомых и Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, проект Хэтч 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
Referências
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
