इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफिक अध्ययन के लिए लिपिड मोनोलेयर विधि का उपयोग करके नमूना तैयारी
Summary
दशकों से संरचनात्मक अध्ययनों के लिए दो आयामी (2डी) प्रोटीन क्रिस्टल बनाने के लिए लिपिड मोनोलेयर का उपयोग एक नींव के रूप में किया गया है। वे एयर-वॉटर इंटरफेस पर स्थिर हैं और इलेक्ट्रॉन इमेजिंग के लिए एक पतली सहायक सामग्री के रूप में काम कर सकते हैं। यहां हम जैविक अध्ययन के लिए लिपिड मोनोलेयर तैयार करने पर सिद्ध कदम प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। घुलनशील या झिल्ली प्रोटीन जैसे मैक्रोमॉलिक्यूल्स को अनुकूल परिस्थितियों में अत्यधिक आदेशित दो-आयामी (2डी) क्रिस्टल में उगाया जा सकता है। उगाए गए 2डी क्रिस्टल की गुणवत्ता 2डी इमेज प्रोसेसिंग के माध्यम से अंतिम पुनर्निर्माण के समाधान के लिए महत्वपूर्ण है। इन वर्षों में, लिपिड मोनोलेयर का उपयोग परिधीय झिल्ली प्रोटीन के साथ-साथ घुलनशील प्रोटीन के 2डी क्रिस्टलीकरण को बढ़ावा देने के लिए एक सहायक परत के रूप में किया गया है। इस विधि को अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के 2डी क्रिस्टलीकरण पर भी लागू किया जा सकता है लेकिन मोनोलेयर को विभाजन को बढ़ावा देने के लिए डिटर्जेंट और डायलिसिस की स्थिति निर्धारित करने के लिए अधिक व्यापक अनुभवजन्य जांच की आवश्यकता होती है। हवा-पानी इंटरफेस पर एक लिपिड मोनोलेयर रूपों जैसे कि ध्रुवीय लिपिड सिर समूह जलीय चरण में हाइड्रेटेड रहते हैं और गैर-ध्रुवीय, एसील चेन, हवा में पूंछ विभाजन, सतह तनाव को तोड़ते हैं और पानी की सतह को सपाट करते हैं। हेड ग्रुप्स की आवेशित प्रकृति या विशिष्ट रासायनिक मोइटीज समाधान में प्रोटीन के लिए आत्मीयता प्रदान करते हैं, 2डी सरणी गठन के लिए बाध्यकारी को बढ़ावा देते हैं। 2डी सरणी के साथ एक नवगठित मोनोलेयर को क्रिस्टलीय सरणी को उठाने और समर्थन देने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्बन-लेपित कॉपर ग्रिड पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) में आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है। इस काम में, हम क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक (क्रायो-ईएम) इमेजिंग के लिए एक लिपिड मोनोलेयर पद्धति का वर्णन करते हैं।
Introduction
प्रोटीन के 2डी क्रिस्टल या पेचिक सरणी के माध्यम से इलेक्ट्रॉन विवर्तन अनुकूल मामलों में उप-नैनोमीटर संकल्प प्राप्त कर सकता है1,2,3. विशेष रुचि के अपने निकट देशी वातावरण में 2डी झिल्ली प्रोटीन सरणी या क्रिस्टल का पुनर्गठन कर रहे हैं1. क्योंकि एक क्रिस्टल विशिष्ट स्थानिक आवृत्तियों पर संरचनात्मक कारकों की तीव्रता को बढ़ाने के संकेत एम्पलीफायर के रूप में कार्य करता है, इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी एकल कण क्रायो-ईएम के लिए उन लोगों की तुलना में उच्च संकल्पों, जैसे छोटे अणुओं पर एक छोटे आकार के साथ एक लक्ष्य की जांच करने की अनुमति देता है। इलेक्ट्रॉन बीम को प्रोटीन की एक आदेशित 2डी सरणी द्वारा डिफ्रैक्ट किया जा सकता है, जो डिटेक्टर4पर छवि विमान के आधार पर एक विवर्तन पैटर्न या जाली छवि उत्पन्न करता है। इसके बाद डिफ्रेक्ट की गई तीव्रता को निकाला जा सकता है और क्रिस्टल की 2डी प्रक्षेपण संरचना को पुनर्निर्मित करने के लिए संसाधित किया जा सकता है। इलेक्ट्रॉनों में एक्स-रे की तुलना में एक बड़ा बिखरने वाला क्रॉस-सेक्शन होता है और इसका बिखराव ज्यादातर अणु5में इलेक्ट्रॉनों और आवेशित परमाणुओं के बीच कूलोम इंटरैक्शन के आधार पर रदरफोर्ड मॉडल का अनुसरण करता है । 2डी झिल्ली क्रिस्टल की मोटाई आमतौर पर 100 एनएम से कम होती है, जो नमूना6के भीतर होने वाले गतिशील बिखरने के बिना इलेक्ट्रॉन संचरण के लिए उपयुक्त होती है। इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलीय अध्ययनों को झिल्ली प्रोटीन और लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन 7 ,8,9,10, 11, 12, 13, 14,15,16,17की उच्च-संकल्प संरचनात्मक जानकारी की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में दिखाया गया है।
एक लिपिड मोनोलेयर एक एकल लिपिड परत है जो एयर-वॉटर इंटरफेस6पर घने पैक किए गए फॉस्फोलिपिड से बना होता है, जो घुलनशील प्रोटीन या परिधीय झिल्ली प्रोटीन18के लिए 2D सरणी गठन में सहायता कर सकता है। लिपिड के घनत्व और उनके पार्श्व दबाव के आधार पर, लिपिड अणु हवा-पानी के इंटरफ़ेस पर एक आदेशित 2डी सरणी बना सकते हैं, जिसमें उनकी एसील चेन हवा में फैली हुई और जलीयसमाधान1,6,19में उजागर हाइड्रोफिलिक हेडग्रुप्स हो सकते हैं। लिपिड हेडग्रुप इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकता है या एक विशिष्ट प्रोटीन डोमेन को बांधने के लिए एक आत्मीयता टैग प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कुत्तों-एनटीए-नी (1,2-डाइलियोल-एसएन-ग्लिसेरो-3-[(एन-(5-अमीनो-1-कार्बोक्सीपेन्टाइल) इमिनो डायेमेटिक एसिड) succinyl]2-Ni 2 +)का उपयोग अक्सर एक लिपिड मोनोलेयर बनाने में किया जाता है ताकि प्रोटीन को पॉली-हिस्टिडीन टैग20,21,222के साथ बांधा जा सके । इसके अलावा, हैजा टॉक्सिन बी23, 24के लिए लिपिड मोनोलेयर में गैंगलियोसाइड जीएम1 के एक विशेष पेंटासैचराइड को बांध सकता है। लिपिड हेडग्रुप पर प्रोटीन को एंकर करके, लिपिड मोनोलेयर 2डी सरणी के गठन में सहायता कर सकता है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलीय अध्ययनों के लिए पतले हैं। प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए इलेक्ट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी में लिपिड मोनोलेयर तकनीक का उपयोग किया गया है, जैसे स्ट्रेप्टाविडिन2,25,एनेक्सिन वी26,हैजा टॉक्सिन27, ई कोलाई जायरास बी सबयूनिट28, ई कोलाई आरएनए पॉलीमरेज25,29,30,कार्क्सीसोम शेल प्रोटीन31 और एचआईवी-132 और मोलोनी मुरीन ल्यूकेमिया वायरस के कैप्सिड प्रोटीन 33लिपिड मोनोलेयर की स्थिरता और रासायनिक संपत्ति के कारण, क्रायो-ईएम इमेजिंग34के लिए नमूना तैयार करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों का पता लगाया गया है। हालांकि, प्रोटीन सरणी गठन के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी।
यहां, हम क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए लिपिड मोनोलेयर की सामान्य तैयारी और कुछ विचारों का व्यापक विवरण प्रदान करते हैं जो गठित मोनोलेयर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक लिपिड मोनोलेयर एक शक्तिशाली उपकरण है जो जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के संरचनात्मक अध्ययन के लिए बड़े 2डी क्रिस्टल के विकास की सुविधा प्रदान करता है। वायु-जल इंटरफ़ेस पर एक बरकरार लिपिड मोनोलेयर को सफ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि की तैयारी आंशिक रूप से अमेरिकी सेना अनुसंधान कार्यालय (W911NF2010321) और एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड द्वारा पी-एल.C के लिए समर्थित था ।
Materials
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
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